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1、作者单位: 710032 西安, 解放军第四军医大学西京医院检验科 (彭道荣、 徐焰、 张小宁、 苏明权、 孙怡群、 郝晓柯) ; 第三军医大学军 队流行病学教研室 (熊鸿燕) 通讯作者: 郝晓柯, 电子信箱: haoxkg fmmu. edu. cn 基础实验诊断研究 噬菌体宿主谱改变核酸分析研究 彭道荣 徐焰 熊鸿燕 张小宁 苏明权 孙怡群 郝晓柯 【摘要】 目的 探讨一种高效提取 RNA 噬菌体核酸的新方法, 并通过核酸分析从基因水平了 解宿主谱改变对噬菌体核酸的影响。方法 采用传统的聚乙二醇 (PEG) 沉淀-蛋白酶消化-酸性酚提 取法、 Tripure 提取法以及抗体沉淀-盐酸胍一步
2、法 3 种方法分别提取大肠埃希菌 f2噬菌体及其宽宿 主谱株的 RNA, 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度。采用兼并引物逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 及 随机引物随机扩增多态性 DNA 聚合酶链反应 (RAPD-PCR) 比较分析噬菌体宿主谱改变前后其核酸 序列组成的变化。结果 抗体沉淀-盐酸胍一步法提取的噬菌体核酸具纯度高、 条带完整等优点; f2 噬菌体及其宽噬株均为 6 000 bp 左右的单链 RNA 噬菌体; 两噬菌体基因 cDNA 扩增出的 RAPD-DNA 片段差异明显, 其中 26 条为可区分的 DNA 带型; 噬菌体 f2cDNA 在 450 bp 附近出现重复性较好的扩
3、 增片段, 而其宽噬株 cDNA 在相同条件下未出现扩增产物。结论 抗体沉淀-盐酸胍一步法较其他两 种 RNA 病毒核酸提取法具有明显的优势, 具有应用价值的新的 RNA 噬菌体核酸的提取方法; 宽宿主 谱噬菌体的宿主特异性裂解效应已从基因水平发生了变化。 【关键词】 RNA; 噬菌体; 逆转录聚合酶链反应; 随机扩增多态 DNA 技术 Extracting and comparing analysis the nucleic acid from E. coli bacteriophage with broad host range PENG Dao-rong*,XU Yan, XIONG H
4、ong-yan, ZHANG Xiao-ning, SU Ming-quan, SUN Yi-qun HAO Xiao- ke. *Department of Clinical Laboratories,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710032, China Corresponding author: HAO Xiao-ke, Email: haoxkg fmmu. edu. cn 【Abstract】 Objective To establish a new assay for extracting nucl
5、eic acid from RNA phage. Through analysis test for Nucleic acid investigate the gene change of bacteriophage with broad host range, to study the mechanism of phage host specificity and anti-bacteria effects. Methods Comparing the three kinds of assay to extract the nucleic acid from phage f2and phag
6、e f2with broad host range by PEG- Protease k- Phenol,Tripure and anti-serum-carbamidine hydrochloride respectively. Then valuated their purity with agarose gel electrophoresis. Comparing analysis the differences of nucleic acid sequence between phage f2and phage f2with broad host range with RT-PCR a
7、nd RAPD-PCR. Rusults The anti-serum- carbamidine hydrochloride-one-step assay is the best one than others. Analysis test for Nucleic acid revealed that two phage were a 6 000 bp , single-stranded RNA bacteriophage. Significant differences in its specificity of RAPD-PCR and RT-PCR were founded before
8、 and after host range change;There were 26 RAPD-cDNA fragments that can be difference in two phage RAPD-PCR product;The RT-PCR product of phage f2was 450 bp cDNA fragment,but the phage with broad host range hadn t PCR product. Conclusion The anti-serum- carbamidine hydrochloride-one-step assay is on
9、e kind of new assay who has advantage obviously than other tradition assay to extract the nucleic acid from RNA phage. Analysis test for Nucleic acid indicated that host- specific lytic effect of phage xy-1 had been changed in genic level. 【Key words】 RNA; Bacteriophage; Reverse transcription polyme
10、rase chain reaction; Random amplified polymorphic DNA 近年来, 抗生素耐药菌株的出现对细菌感染的 治疗及消毒方法构成了严峻挑战, 使得噬菌体再度 成为关注热点 1。噬菌体作为抗菌制剂的应用前 景还有赖于突破其对宿主菌识别和裂解的特异性限 制。我们在研究中发现并筛选到一株可同时裂解 5 种不同株大肠埃希菌的 f2噬菌体的宿主谱突变株。 为了进一步了解其宿主特异性改变的机制, 建立一 种得率高、 核酸纯度好、 降解程度低的 RNA 噬菌体 核酸的提取方法是进行噬菌体研究的关键环节。我 们尝试改良的抗体沉淀-盐酸胍一步法提取 RNA 噬 748中
11、华检验医学杂志 2005 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin J Lab Med, August 2005,Vol 28,No. 8 菌体核酸的方法。运用该法对噬菌体 f2及其宽噬 株核酸进行 RT-PCR 和 RAPD-PCR 反应取得了较为 满意的结果, 为促进噬菌体突破型特异性限制的研 究奠定了基础。 材料和方法 一、 材料 1. 标本来源: 大肠埃希菌 285 及噬菌体 f2(军 事医学科学院四所梁增辉教授惠赠) ; 噬菌体 f2宽 宿主谱株 (可裂解大肠埃希菌 285、 大肠埃希菌 BL21、 大肠埃希菌 JM109、 大肠埃希菌 DH5、 大肠 埃希菌 ATCC25922)
12、 分离自医院污水处理站。 2. 试剂和仪器:RNA PCRS 试剂盒 (宝生生物 工程有限公司) ; 合成引物 (上海申友) ; 随机引物 (北京赛百盛基因技术有限公司) ; 盐酸胍、 巯基乙 醇(鼎国试剂); Tripure (Roche) ; 自动凝胶成像及 分析系统 (Bio-RAD) 。 二、 方法 1. 噬菌体宿主谱观察: 将梁增辉教授惠赠的野 生型噬菌体 f2株和分离自污水站的噬菌体 f2宽宿 主谱株分别与大肠埃希菌 285、 大肠埃希菌 BL21、 大肠埃希菌 JM109、 大肠埃希菌 DH5、 大肠埃希菌 ATCC25922、大 肠 埃 希 菌 8099、大 肠 埃 希 菌 A
13、TCC10536 共 7 种宿主菌及非宿主菌进行交叉培 养, 通过噬菌斑观察它们的裂菌谱。 2. 噬菌体核酸提取: PEG 沉淀-蛋白酶消化-酸 性酚提取法, 采用 Sambrook 等 2的方法改进后进 行。将两噬菌体原液经 DNase I 及 RNase A 消化降 解宿主菌来源的核酸后, 用 PEG-8000 沉淀病毒颗 粒, 蛋白酶 K 消化衣壳蛋白, 酚、 氯仿抽提噬菌体核 酸, 无水乙醇洗涤沉淀, -70保存。 抗体沉淀-盐酸胍一步法: 采用周翔等 3的方 法, 改进后进行。利用两噬菌体原液免疫家兔制备 噬菌体抗血清 4, 5; 10 ml 噬菌体原液中加入终浓度 各 1 g/ m
14、l 的 DNase I 及 RNase A 降解宿主菌来源 的核酸; 等体积氯仿抽提上层水相, 加入 400 l 噬 菌体抗体血清室温放置 1 2 h 后离心留取沉淀; 加 入 1. 5 ml 8 mol/ L 盐酸胍溶液、 1. 5 ml 0. 1 mol/ L 巯基乙醇、 终浓度 0. 5% 的 10% SDS、 1/10 体积 2 mol/ L NaAc (pH 5. 2) , 混匀; 酸性酚: 氯仿: 异戊醇 (24: 24: 1) 抽提, 离心收集上层水相; 无水乙醇洗涤 沉淀, -70保存备用。 Tripure 提取法: Tripure 与噬菌体原液等体积混 合; 匀浆室温孵育后,
15、 氯仿、 异丙醇分别抽提水相; 75%乙醇沉淀洗涤 RNA, -70保存备用。噬菌体 核酸均经琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体核酸纯度。 3. 噬菌体核酸定性及定量分析: 核酸定量仪定 量噬菌体 RNA 浓度; 用 DNA 酶及 RNA 酶消化噬菌 体核酸定性核酸性质。 4. 噬菌体核酸简并引物 RT-PCR 反应:引物设 计及合成。因噬菌体 f2的核苷酸全序列测定工作 尚未公布, 资料显示其属单链 RNA 大肠埃希菌噬菌 体类群 6, 所以我们根据 4 种已完成全序列核苷 酸测定的单链 RNA 大肠埃希菌噬菌体中高度同源 的保守序列和已公布的大肠 f2噬菌体的 58 bp 的衣 壳蛋白基因的已知序列
16、通过 primer5. 0 软件设计一 对简并引物尝试扩增未知序列的噬菌体 f2及其宽 宿主谱株的 cDNA, 以观察其宿主谱改变前后基因 组成的变化。其中 Anti 引物为简并引物, 序列: CCT KCKACGAGCCTAAAT; Sense 引物序列: AAATCTGG AACTAACTATTC。 RT-PCR 反应: 参照 TaKaRa RNA PCR kit Ver2. 1 试剂盒使用说明进行, 退火温度梯度为 50. 4、 54. 8、 58. 5、 60. 5。 5. 噬菌体随机引物 RAPD-PCR 扩增: 引物及其 序列。选用北京赛百盛基因技术有限公司生产的 5 条随机系列引
17、物分别对两噬菌体 RNA 进行逆转录 和 RAPD-PCR 扩增, 对其进行 DNA 多态性分析。 逆转 录 反 应 及 RAPD-PCR: 逆 转 录 反 应 及 RAPD-PCR 反应体系同 RT-PCR, 退火温度梯度分别 为 40. 7、 46. 0。 结果 1. 噬菌体 f2及噬菌体 f2宽宿主谱株的裂菌谱 变化: 大肠埃希菌噬菌体 f2分别与大肠埃希菌 285、 25922、 BL21、 JM109、 HD5、 8099、 10536 直接进行交 叉培养后, 除其宿主菌大肠埃希菌 285 外均未见噬 菌斑出现, 结果显示, 噬菌体 f2不能直接对非宿主 菌进行裂解。噬菌体 f2宽宿
18、主谱株则能裂解大肠 埃希菌 285、 大肠埃希菌 BL21、 大肠埃希菌 JM109、 大肠埃希菌 HD5 和大肠埃希菌 25922。它们的裂 菌滴度见表 1。 2. 噬菌体核酸提取: 3 种方法比较, 以抗体沉 淀-盐酸胍一步法提取的噬菌体核酸纯度最好、 条带 完整。 3. 噬菌体核酸的定性和定量分析: DNAseI和 848中华检验医学杂志 2005 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin J Lab Med, August 2005,Vol 28,No. 8 表 1 噬菌体 f2及噬菌体 f2宽宿主谱株的裂菌滴度 噬菌体 噬菌体针对不同宿主菌的裂解滴度 (PFU/ ml) 大肠埃希菌
19、 285大肠埃希菌 BL21大肠埃希菌 JM109大肠埃希菌 HD5大肠埃希菌 25922 噬菌体 f2宽宿主谱株 6. 5 1094. 5 1073. 3 1054. 6 1063. 7 108 噬菌体 f2 3. 05 1011- RNase A 降解反应证实噬菌体 f2及其宽噬株核酸均 为 RNA, 在 RNase A 中完全降解。因 RNase A 在 NaCl 浓度为 3 mol/ L 或更高时, 可特异性切割单链 RNA, 所以上述噬菌体的核酸在以上条件下的降解 可证实它们均为单链 RNA 噬菌体。 核酸定量仪分析也进一步证实噬菌体 f2及其 宽噬株核酸均为 RNA, 浓度分别为:
20、 3. 1 g/ ml 和 3. 0 g/ ml; A260/ A280分别为: 1. 96 和 1. 91。 4. 噬菌体核酸简并引物 RT-PCR 反应: 利用简 并引物对两噬菌体 (噬菌体 f2及其宽宿主谱株) 核 酸进行 RT-PCR 反应, 噬菌体 f2cDNA 在 450 bp 附 近出现重复性较好的扩增片段, 而宽宿主谱噬菌体 cDNA 在相同条件下未出现扩增产物。以简并引物 在退火温度梯度为 50. 4、 54. 8、 58. 5、 60. 5 条件下的 RT-PCR 产物见图 1。 M: DNA 标准参照物 DL 2 000; 1 4: 宽宿主谱噬菌 体 PCR 扩增结果;
21、5 8: 噬菌体 f2PCR 产物 (450 bp) 图 1 噬菌体 f2及其宽宿主谱株的简并引物 RT-PCR 产物 5. 噬菌体随机引物 RAPD-PCR 扩增: 利用 5 个 随机引物对两噬菌体 (噬菌体 f2及其宽宿主谱株) 核酸进行 RAPD-PCR 扩增, 筛选出 3 个具有多态性 且重复性好的引物。另外两个引物无扩增产物。 RAPD 扩增片段在 300 2 000 bp 的重复性较好, 5 个随机引物具体筛选结果: 没有任何扩增产物的引 物有 2 个 (40%) : 808、 809 引物; 能产生多态性的引 物有 3 个 (60%) :806、 807、 810 引物。以随机引
22、物 807 为下游引物进行反转录, 以随机引物 810 作为 上游引物进行 PCR 扩增, 退火温度梯度分别为 40. 7、 46. 0。 通过上述 3 个随机引物对两噬菌体扩增的 DNA 片段进行分析, 结果表明, 两噬菌体基因 cDNA 扩增出的 RAPD-DNA 片段有明显的差异, 其中 26 条为可区分的 DNA 带型。 讨论 通过对最终获得 RNA 沉淀进行凝胶电泳条带 鉴定及核酸定量仪的检测证实, 免疫抗体沉淀-盐酸 胍变性一步法具有省时、 得率高、 核酸纯度好等优 势, 较适合 RNA 病毒颗粒的核酸提取。本研究证 实, 利用盐酸胍、 巯基乙醇等强烈变性剂去除核蛋 白的污染, 较
23、传统的蛋白酶 K 消化法更彻底, 且可 一定程度防止 RNA 酶污染, 所得 RNA 纯净、 完整。 虽然 RAPD 是一项极有价值的分子标记技术, 但有明显的局限性, 主要表现为受诸因素影响, 导致 稳定性较差 7。为此本研究进行了摸索和条件优 化, 并固定了所建立的最佳反应条件, 避免了外界因 素的干扰, 使整个反应所得数据具有可比性。条件 的优化着重于引物的种类及用量、 PCR 反应体系中 各试剂的浓度配比、 退火温度梯度的控制等 8, 9。 通过对噬菌体 f2及其宽宿主谱株的核酸差异 性的比较研究, 为从基因水平探讨和改变噬菌体宿 主特异性提供了线索, 也为噬菌体宿主谱的人工改 造提供
24、了依据, 但有很多问题尚待深入探讨和研究。 参考文献 1Ugorcakova J, Bukovska G.Lysins and holins:Tools of phage- induced lysis. Biologia(Bratislava) , 2003, 58: 327-334. 2Sambrook J,Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 第 2 版. 北京: 科学出版社, 1996. 215-218. 3周翔, 谭德勇, 王晓燕. 免疫沉淀法分离纯化感染细胞中的甲肝 病毒 RNA. 云南大学报, 1998, 20: 380-382. 4 魏泓. 医学实验
25、动物学. 成都: 四川科学技术出版社, 2000.247-391. 5杨占秋, 余宏. 临床病毒学. 北京: 中国医药科技出版社, 2000. 320-326. 6贾盘兴. 噬菌体分子生物学 基本知识和技能. 北京:科学 出版社, 2001. 1-25. 7Ellsworth DL,Rittenhouse KD,Honeycutt RL. Artifactual variation inrandomlyamplifiedpolymorphicDNAdandingpatterns. Biotechniques, 1993, 14: 214-217. 8任瑞文, 卢强. 提高 RAPD 稳定性的几点经验与探讨. 生物技术 通讯, 2001, 12: 517-518. 9陈维贤, 张莉萍, 叶耀红. 菌液直接进行聚合酶链反应快速检测 葡萄球菌 mecA 基因的研究. 中华检验医学杂志, 2003, 26: 628. (收稿日期: 2005-01-24) (本文编辑: 毛家都) 948中华检验医学杂志 2005 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin J Lab Med, August 2005,Vol 28,No. 8
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