在2215细胞中SIRNA对HBV复制和表达的抑制.pdf
《在2215细胞中SIRNA对HBV复制和表达的抑制.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《在2215细胞中SIRNA对HBV复制和表达的抑制.pdf(3页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、收稿日期 2005 -08 -09 作者简介 张宏斌 (1973 - ) , 男, 陕西省凤翔县人, 主管技 师, 在读博士生, 主要从事临床免疫学研究。Tel: 020-36653433; E-mail: zhangwater tom. com。 在 2. 2. 15 细胞中 siRNA 对 HBV 复制和表达的抑制 张宏斌1, 2,武 婕2,郑文岭2,马文丽1,冼 江2,谢闻悦2,李 薇2 (1. 南方医科大学分子生物学研究所, 广州 510515; 2. 广州军区广州总医院医学实验科, 广州 510010) 摘要 目的: 检测设计的 siRNA 对 HBV 复制和表达的影响。方法: 选择
2、针对乙型肝炎病毒 (HBV) 的 siRNA 基 因序列, 化学修饰合成 3 种 stealth siRNA, 脂质体转染带有 HBV 的 2. 2. 15 细胞, ELISA 法及荧光定量 PCR 检测其 对 HBV 复制和表达的影响。结果: 3 种 stealth siRNA 对 HBV 的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。 结论: HBV 在 2. 2. 15 细胞中的复制和表达被 stealth siRNA 抑制。 关键词 stealth siRNA; 肝炎病毒, 乙型; 抑制; RNA 干涉 中图分类号 R373. 21文献标识码 A 文章编号 1000-5501 (2006
3、) 02-0144-03 siRNA mediated inhibition of HBV replication and expression in 2. 2. 15 cells ZHANG Hong-Bin1, 2,WU Jie2,ZHENG Wen-Ling2,MA Wen-Li1,XIAN Jiang2,XIE Wen-Yue2, LI Wei2 (1. Institute of Molecular Biology,South Medical University,Guangzhou 510515,China;2. Department of Medical Re- search,Gu
4、angzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China) Abstract Objective:To study the effect of siRNA on HBV replication and expression. Methods:The siRNA against HBV were designed and synthesized,then the stealth siRNAs were synthesized by modification of siRNA. Lipofectami
5、neTM 2000 reagent was used for the transfection of 2. 2. 15 cells by stealth-508,stealth-2311 and stealth-2765 or control. Con- centration of HBsAg and HBeAg in the supernatant of the transfected cells were measured using ELISA. Copies of HBV in the transfected cells was measured using quantitative
6、PCR. Results:Compared with controls,these stealth siRNA against HBV decreased concentration of HBsAg and HBeAg and copies of HBV significantly. Conclusion: HBV replication and ex- pression in 2. 2. 15 cells are inhibited by stealth siRNA. Key words stealth siRNA; hepatitis B virus; inhibition; RNA i
7、nterference 乙型肝炎病毒 (HBV) 是一种长 3. 2 kb 的 DNA 病毒, 几 乎可以在整个肝脏复制, 是引起肝脏疾病及诱发肝癌的突出 病原 1。虽然有高活性的乙肝疫苗, 而且已广泛使用了 20 多年, 但 HBV 的感染仍然是一个危害全球健康的重大疾病。 全球有超过 3. 5 亿的 HBV 感染者, 而且每年急慢性 HBV 感 染致死人数约有一百万之多 2。目前, 干扰素和腺苷类似物 如拉米夫定是仅有的几种抑制 HBV 复制的药物, 但其效果 很有限。 RNA 干涉 (RNA interference,RNAi) 现象是指内源性或 外源性双链 RNA (double st
8、rand RNA, dsRNA) 介导的转录后 的靶基因沉默 (PTGS) 3。在哺乳动物细胞中 RNAi 活性是 通过 21 23 nt 的 小 干 涉 RNA ( small interfering RNAs, siRNA) 来实现的 4 6。siRNA 已在很多研究领域显示出对 目的基因的清除作用, 这对于 HBV 感染的治疗也是一种可 选的重要手段。我们针对 HBV 设计合成了 stealth siRNA, 然 后研究其对 2. 2. 15 细胞中 HBV 复制和表达的影响。 1 材料和方法 1. 1 实验材料 DMEM 细胞培养液购自 Gibco 公司。胎牛血清 (FBS) 为 TB
9、D 公司产品。G418 为 Clontech 公司出品。2. 2. 15 细 胞由第四军医大学薛彩芳教授惠赠。Lipofectamine2000 为 Invitrogen 公司产品。HBV 表面抗原及 e 抗原的 ELISA 检测 试剂盒为深圳华康生物医学工程有限公司产品。HBV 核酸 扩增 (PCR) 荧光定量检测试剂盒购自深圳市匹基生物工程 股份有限公司。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 siRNA 的设计与合成 应用 Invitrogen 公司网络在 线工具设计 siRNA 的靶向位点。在编码区起始位点后选择 441 军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 4 期
10、 Bull Acad Mil Med Sci,Apr 2006; Vol 30 No 4 3 个位点, 依次命名为 stealth-508、 stealth-2311 和 stealth- 2765。其中, stealth-508 靶向 HBV 基因组的 S 区和 P 区 (nt508 532) , stealth-2311 靶向 HBV 基因组的 C 区和 P 区 (nt2311 2335) , stealth -2765 靶向 HBV 基因组的 P 区 (nt2765 2789) 。依照此序列由 Invitrogen 公司合成化学修 饰的 siRNA (即 stealth siRNA) 。
11、 1.2. 2 细胞培养及鉴定 2. 2. 15 细胞用含 80 ml/ L 胎牛血 清 FBS, 200 g/ ml G418 的高糖 DMEM (Dulbecco s modified Eagle s minimal essential medium) 在 37 50 ml/ L CO2培养 箱中培养, 48 h 后收集培养上清,HBV 表面抗原及 e 抗原检 测试剂盒 ELISA 法检测。 1.2. 3 RNAi 及 ELISA 检测 培养好的 2. 2. 15 细胞消化收 集, 重悬于无血清 DMEM 中计数, 分至 24 孔板, 400 l/ 孔含 2 104个细胞, 2 l ste
12、alth siRNA 及对照分别混匀于 50 l 无血清 DMEM; 同时 1 l 脂质体 Lipofectamine 2000 混匀于 50 l 无血清 DMEM, 室温 5 min; 然后将 siRNA 悬液和脂质 体悬液对应混合, 室温 20 min; 将混合物分别加至 24 孔板细 胞中混匀, 37 50 ml/ L CO2培养箱中培养。12 h 后更换完 全培养液 DMEM (含血清和 G418) , 24 h, 48 h, 72 h 及 96 h 收集培养上清,HBV 表面抗原及 e 抗原检测试剂盒 ELISA 法检测。 1. 2. 4 RNAi 及 PCR 检测 培养好的 2.
13、2. 15 细胞消化计 数, 24 孔板中 2 103个/ 孔细胞完全培养液 DMEM 继续培养 24 h, 待细胞贴壁, 更换为无血清 DMEM (400 l/ 孔) , 5 l stealth siRNA 及对照转染 (方法同 1. 2. 3) , 12 h 后更换完全 培养液 DMEM, 48 h 后消化收集细胞, 各加 500 l 裂解液充 分裂解细胞, HBV 核酸荧光定量试剂盒检测。 1. 2. 5 统计学处理 RNAi 实验均使用不同批次培养的 2. 2. 15细胞重复 3 次, 然后采用组间均数比较 t 检验。 2 结果 2. 1 stealth RNA 的分析 Invitro
14、gen 公司 stealth siRNA 合成质量报告, 序列见表 1; Blast 结果: 与人类基因组数据库无完全同源序列, 与 HBV 基因序列完全同源; 纯度: 盐析级。 表 1 stealth RNA 的序列 名 称序列 (5to 3) stealth-508 senseGGGACCAUGCAGAACCUGCACGAUU stealth-508 antisenseAAUCGUGCAGGUUCUGCAUGGUCCC stealth-2311 senseCCCUAUCUUAUCAACACUUCCGGAA stealth-2311 antisenseUUCCGGAAGUGUUGAUAAGA
15、UAGGG stealth-2765 senseGGCUGGCAUUCUAUAUAAGAGAGAA stealth-2765 antisenseUUCUCUCUUAUAUAGAAUGCCAGCC 2. 2 2. 2. 15 细胞的鉴定 细胞培养上清 ELISA 检测 HBV 表面抗原及 e 抗原结果 均为阳性。 2. 3 RNAi 的 ELISA 检测 3 种 siRNA 对 HBV 的表达均有一定的抑制 (定性结果 见表 2) ; 进一步定量分析结果见图 1 和图 2, 其中对表面抗 原表达的抑制三者均有显著作用 (P 0. 01) , 而对 HBV e 抗 原的表达抑制仅 stealth-
16、2311 较为显著 (P 0. 05) 。 表 2 stealth RNA 对 HBV 的抑制 24 h48 h72 h96 h stealth-508- stealth-2311- stealth-2765- control-+ 图 1 HBV 表面抗原的抑制 图 2HBV e 抗原的抑制 2. 4 RNAi 的 PCR 检测 2.2. 15 细胞经 RNAi 处理后, 荧光定量 PCR 检测显示 3 种 stealth siRNA 对 HBV 复制的抑制作用显著。3 种 stealth siRNA 处理的实验组 HBV 的拷贝数均 5 102(因试剂盒 灵敏度为 5 102拷贝/ ml,
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 2215 细胞 SIRNA HBV 复制 表达 抑制
链接地址:https://www.31doc.com/p-3703944.html