地塞米松抑制哮喘小鼠SH2-Bβ蛋白表达.pdf
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1、中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 ( 1 1 ) :1 5 0 1 4 1 5 0 l 地塞米松抑制哮喘小鼠S H 2 一B 1 3 蛋白表达 齐金萍,王巧玲,金韵,胡颖 ( 沈阳医学院解剖学教研室辽宁沈阳1 1 0 0 3 4 ) 中国图书分类号:R - 3 3 2 ;R - 3 2 2 3 5 ;R3 2 2 8 1 ;R3 9 2 1 l ; R5 6 2 2 5 0 5 3 :R 9 7 7 1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1 1 9 7 8 (
2、 2 0 0 8 ) 1 1 1 5 0 1 0 4 摘要:目的探讨地塞米松对哮喘小鼠肺及内脏感觉传入系 统( c ,一T 5 脊神经节及对应的脊髓后角) S I - 1 2 B B 表达的抑制 作用。方法用卵蛋白法制备B A B L c 小鼠哮喘模型,应用 免疫组织化学和免疫印迹法,观察S H 2 B B 在哮喘小鼠肺及 内脏感觉传入部位的表达及地塞米松对其表达的影响。应 用小鼠肺功能仪检测气道阻力的变化。结果在肺组织、 c ,T 5 段脊神经节及相应节段的脊髓后角内,哮喘组S H 2 - B 6 表达明显高于对照组和地塞米松组( P 0 叭) 。哮喘组气 道阻力明显高于正常组及地塞米松组(
3、 P 0 0 1 ) 。结论 地塞米松抑制哮喘小鼠S H 2 - B B 的表达可能是激素治疗哮 喘的机制之一。 关键词:S H 2 一B t 3 ;地塞米松;肺;脊神经节;脊髓;哮喘;小鼠 哮喘是一种以气道阻力、气道炎症和气道高反 应性为特征的常见病。其发病机制尚不清楚。 近年来,神经源性炎症越来越受到关注,但对于神经 系统与这些炎症过程的复杂相互作用了解甚少。研 究提示,神经生长因子( N G F ) 通过作用于炎性细 胞、作用于神经元参与哮喘时的气道炎症反应、气道 收缩和气道高反应性口3o 。T r k A 是N G F 的高亲和 力受体,S H 2 一B B 是T r k A 的结合蛋
4、白,属细胞内连接 物蛋白,是N G F 诱导神经元分化所必需的信号分 子“ 1 。我们以往的研究表明S H 2 一S 1 3 在哮喘小鼠的 肺及C ,- T ,脊神经节过表达”J ,经鼻应用N G F 抗体 可降低其表达【6 J 。这表明在哮喘发病中,S H 2 一B B 可能是N G F T r k A 通路中的重要信号分子。激素被 世界卫生组织认为是目前最有效的治疗哮喘的药 物,但具体的作用机制尚不清楚。S H 2 B B 会不会是 激素发挥作用的重要蛋白呢? 本实验通过观察地塞 收稿日期:2 0 0 8 0 7 0 8 修回日期:2 0 0 8 0 9 一l O 基金项目:辽宁省教育厅基
5、金资助项目( N o2 0 0 6 0 8 9 0 ) ;沈阳医学院 优秀人才基金资助项目( N o2 0 0 7 3 0 2 2 ) 作者简介:齐金萍( 1 9 7 0 一) ,女,博士,副教授,研究方向:神经肽与 临床疾病,T e l :0 2 4 - 8 1 7 9 8 4 3 8 ,E m a i l :q l j i n p i n 9 2 0 0 0 y a - b o o o D m c n 米松对哮喘小鼠气道阻力的影响及对S H 2 - B B 表达 的影响,探讨它的平喘机制,为哮喘的治疗提供新思 路。 1 材料与方法 1 1 材料和仪器清洁级6B A L B c 小鼠,重1
6、9 2 lg ,购于中国科学院。S H 2 一B 1 3 羊多克隆I g G 抗 体,辣根酶标记小鼠抗羊I g G H R P 、E C L 发光试剂盒 ( 美国S a n t aC r u zB i o t e c h n o l o g y 公司) ;B a c t i n 小鼠 单克隆I s G 抗体、S A B C 试剂盒及D A B ( 中国武汉博 士德生物公司) 。其余为国产分析纯。 主要仪器包括:电子天平( B S l l 0 S ) ,德国S t a r - t o r i u s 公司。内切式电动组织匀浆器,瑞士K i n e m a t i c a 公司。超声雾化器( J
7、w C - 2 0 1 D 型) ,北京超声仪 器厂。紫外分光光度计( D U 7 0 型) ,美国B e c k m a n 公司。电泳转印仪,美国B i o R a d 公司。 1 2 方法 1 2 1 动物模型的建立与分组按随机数字表法 将6 0 只小鼠分为正常对照组( N S ) 、哮喘组( O V A ) 和地塞米松组( D E X A ) 每组2 0 只。哮喘组:d1 每只小鼠腹腔注射2 0 鹇卵蛋白( O V A ) 和2m g 氢 氧化铝混合于0 5I I l l 磷酸盐缓冲液( P B S ,0 1m o l L p H7 4 ) 中。d8 和d1 4 每只小鼠腹腔注射 1
8、0 g 卵蛋白( O V A ) 和lm g 氢氧化铝混合于0 5 m lP B S 中。d2 6 3 0 将小鼠置于封闭容器中,给予 5 0g L _ O V A ( P B S 配成) 雾化吸入激发哮喘发作, 每天1 次,每次2 5m i n ;正常对照组:以P B S 代替 O V A 注射和雾化吸入,其余均与哮喘组相同;地 塞米松组:小鼠用同样方法致喘,并于每次激发前3 h 腹腔注射D E X A2m g k g 。各组最后1 次激发 后2 4h 处死。 1 2 2 气道阻力的测定d3 1 ,小鼠经1 戊巴比 妥钠腹腔麻醉( 4 0m g k g 一) ,1 6G 气管插管,用 A n
9、 i R e s2 0 0 3 动物肺功能分析系统( B e i l a n b o kl i m i t e d c o m p a n y ,C h i n a ) 测定气道阻力。呼吸频率为1 6 7 b r e a t h s 8 ,潮气量为0 2m l ,正压气压为0 0 2 一 O 0 4k P a 。经颈静脉浓度梯度增加应用m e t h a c h o - l i n e ( M C h ) 0 0 2p g g 。1 激发气道阻力。待曲线 平稳后进行下一次给药。 1 2 3W e s t e r nb l o t 分析S H 2 S 1 3 表达 动物用 万方数据 1 5 0
10、2 中1 3 t 药理学通报C h i n e s e 确甜啪肋幼疵n zB u l l e t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 ( 1 1 ) l 戊巴比妥钠腹腔麻醉( 4 0m g k g 。1 ) ,断头取 肺、c 7 一T 5 节段的脊髓。一7 0 0 C 储存。用R I P A 试剂 抽提可溶性蛋白,制备S D S 一聚丙烯酰胺凝胶,样品 加热变性后每孔加等量蛋白样品,电泳后湿转至硝 酸纤维素膜上。5 0g L - I 脱脂奶粉T r B S 缓冲液室 温振荡封闭3h 后洗膜,一抗S H 2 8 1 3 ( 1 :3 0 0 ) 或B a c t i n ( 1 :3 0
11、 0 ) 室温孵育2h ,洗膜,辣根酶标记小鼠 抗羊I g G - B i n ( 1 :50 0 0 ) 室温孵育lh ,洗膜后加入 E C L 反应1m i n ,暗室曝光显影后冲洗胶片。凝胶成 像分析系统上摄像分析,计算出相对光密度值。 1 2 4 免疫组织化学反应( S A B C 法) 检测S H 2 - B B 表达动物用1 戊巴比妥钠腹腔麻醉( 4 0m g k g 叫) ,用0 1t o o l L “P B S 配制的含有4 0g L 。1 多聚甲醛灌流液灌流固定后取C ,- T 5 脊神经节,后 固定2 4h 后移入0 8 7m o l L 。1 的蔗糖缓冲液中至 标本沉降
12、。O C T 包埋,恒冷箱连续切片( 厚1 4 m ) ,冷风干燥后进行免疫组织化学染色( S A B C 法) 。一抗S H 2 一B B 工作浓度为1 :1 5 0 ,D A B 显色。 经S I - 1 2 一B B 免疫组织化学染色的脊神经节切片,每 例动物随机取3 4 张切片,且各组所选部位相同, 每张切片平均选取4 个视野,使用M e t a m o p h 图像分 析系统,进行光密度测定。测量值与相应阴性对照 切片测量值相减后的平均值为各区域最终平均光密 度值。 1 3 统计学处理所有数据均用髫s 表示,利用 S P S S l l 0 统计软件进行统计分析,指标比较采用单 因素
13、方差分析,两组间比较采用t 检验。 2 结果 2 1 地塞米松对气道阻力的影响在M C h 激发 下,哮喘组较正常组小鼠气道阻力及气道反应性明 显增高,而D E X A 组气道阻力较哮喘组明显降低 ( F i g1 ) 。 2 2免疫组织化学结果显示 哮喘组脊神经节 ( F i g2 B ) 细胞膜与细胞质及细胞核均有S H 2 8 1 3 免 疫阳性产物,平均光密度值为0 7 4 9 0 0 2 3 ,较对 照组( F i g2 A ) 0 2 1 l 0 0 4 9 升高( P 0 0 1 ) 。而 D E X A 组( F i g2 C ) 为0 3 2 8 0 0 3 6 ,较哮喘组明
14、显 降低( P 0 0 1 ) 。 2 3W e s t e r nb l o t 结果显示 哮喘组脊髓后角和 肺S H 2 B B 表达量高于对照组( P 0 0 1 ) ,而D E X A 组较哮喘组明显降低( P 0 0 1 ,F i g3 ,T a b1 ) 。 3 讨论 本实验观察到地塞米松降低哮喘小鼠的气道阻 力,降低肺及内脏传人部位S H 2 一B B 的蛋白表达,说 明S I - 1 2 B B 是地塞米松治疗哮喘的重要信号分子。 o o O 0 O o o o o O 0 0 0 00 0 2 50 0 5O 1o 2 M C h pg g 1 盹1 E f f e c to
15、 f 山瑰蛐姥山姗eO l la i r w a yr e s i s t a n c ei nn 哪o 嘴t o m e t h a c h o l i n e ( M C h ) c h a l l e n g e s P O 0 1 埘N Sa n dD E X A 3T h eW e s t e r nb l o to fS H 2 B BJ nl u n ga n ds p i n a lc o r d 1 :N Sg r o u p ;2 :O V Ag r o u p ;3 :D E X Ag r o u p T a b1 C o m p a r i s o no ft h er
16、 a t i oo fS H 2 - n 1 3M O D t oI t - m i nM O D b yW e s t e r nb l o t ( x - t - a 。n = 1 0 ) P 0 0 1 埘N Sa n dD E x A 研究证实7 1 ,i n t e d e u k i n 1 8 ( I L 。l B ) 或t u m o u r n e c r o s i sf a c t o r 一仪( T N F I X ) 处理的人气道上皮细胞所 产生的N G F 明显多于单纯培养组,而地塞米松对之 ,I电d)8鼋置墅 咖 咖咖 o 3 2 l 釜萎 万方数据 中国药理学通
17、报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8N o v ;2 4 ( 1 1 )。1 5 0 3 起抑制作用。除了抑制N G F 的产生,地塞米松还能 抑制哮喘豚鼠肺内脏感觉传入部位T r k A 表达1 。 而S H 2 1 3 1 3 在神经细胞中与磷酸化的T r k A 受体相 结合并作为T r k A 激酶的底物pJ ,是重要的细胞内 N G F T r k A 信号通路分子。S H 2 一B 1 3 为N G F 介导的 P C I 2 细胞生存和发育所必需H J 。本实验观察到地 塞米松降低肺内
18、及内脏传人部位S H 2 一B 1 3 的蛋白表 达,这可能是地塞米松通过抑制N G F T r k A 信号途 径降低其下游S H 2 一B 1 3 的表达,最终对哮喘起到治 疗作用。S H 2 一B 是一个大多数丝裂原受体的直接细 胞连接靶,属细胞内连接物蛋白,有4 种同分异构体 仅,1 3 ,1 ,8 【1 0 1 1J 。这些介子与信号转导有关,它们是 生长素受体及其受体激酶的下游,还包括胰岛素、胰 岛素样生长因子、血小板源性生长因子,神经生长因 子等。糖皮质激素与其受体结合而发挥抗炎、免疫 抑制和抗过敏作用【1 2 1 3 J 。S H 2 一B 1 3 是否直接作用于 糖皮质激素受
19、体,地塞米松对其表达的抑制作用是 否还可通过其受体直接实现值得进一步研究。 S H 2 一B 还是瘦素敏感性、能量平衡和体重的重 要调节者,S H 2 一B 敲除鼠则出现瘦素抵抗和肥 胖【1 4 l 。地塞米松的副作用恰是它可以导致肥胖,那 么这种副作用是否也与地塞米松降低S H 2 一B 的表 达有关呢? 对炎症部位降低S H 2 B 的表达起到了 治疗作用,对其他部位而言,降低了S H 2 一B 的表达 则会出现瘦素抵抗和肥胖,这很可能是地塞米松导 致肥胖的重要机制。 参考文献: 1 张洪泉,武玉清,周成华孟鲁司特对哮喘豚鼠嗜酸粒细胞炎 症的抑制作用 J 中国药理学通报,2 0 0 4 ,
20、2 0 ( 7 ) :7 9 7 8 0 0 1 】她1 t Q ,w uY Q ,Z h o u c H 1 n h i b i t i n g d e e to f m o n t e l u l u l s t o i l e o s i n o p h i l i ea i r w a yi n n l w f l l m a t i o no fl l f l t h I B a t i l ! g u i l l p 嗨 J 】C h n P h a r m a e o oB u ,2 0 0 4 ,7 , 0 ( 7 ) 7 9 7 8 0 0 2 李东培,才丽平,方秀斌哮喘豚鼠
21、下呼吸道及内脏传入部位 I 、I G F 表达的研究 J 解剖学报,2 0 0 2 ,3 3 ( 4 ) :3 5 0 - 4 2 】“DP 。C a iLP ,F a n gXB As t u d yO I lN G Fe x p r e i o ni nl o w e r 静 s p i r a t o r yt r a c ta n dv i - r a la f f e r e n ts y s t e mo fa s t h m a t i cg u i n e ap i g J 】4 e t aA n a t $ n ,2 0 0 2 ,3 3 ( 4 ) :3 5 0 - 4 3
22、 曹德寿,刘晓湘,方秀斌哮喘豚鼠初级传入神经元E R K 的表达 及N G F 的调节作用 J 解剖科学进展,2 0 0 4 ,1 0 ( 1 ) :为一5 3 】C a oDS ,b uxX ,F a n gXB E x p r e s s i o no fE R Ka n dt h er e s u l 1 0 r y e f f e c to fN G Fi nt h ep r i m a r ya f f e r e n tm u r o o ft h eI 捌h l l l l l t i c g u i i a e ap i g s j 】晰A n a t 瓤,2 0 0 4 ,1
23、 0 ( 1 ) :2 3 - 5 4 R u iL ,l t e r r i n t g t o nJ ,1 2 a t e r - S u c S I t 2 一Bi sr e q u i r e df o rl m O , , w t hf a c t o r - i n d u c e dn e u r o n a ld i f f e r e n t i a t i o n J rB o C h e m , 1 9 9 9 。2 7 4 ( 1 5 ) :1 0 5 9 0 4 5 齐金萍,曹德寿,刘晓湘,等哮喘小鼠肺内及内脏传入系统 S l - 1 2 - B 1 3 的表达 J
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- 地塞米松 抑制 哮喘 小鼠 SH2 蛋白 表达
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