地塞米松对前列腺癌DU145细胞ERK12活性和CYCLIN D1表达的影响.pdf
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1、 2006 年 4 月 第 13 卷 第 2 期 中国肿瘤生物治疗杂志 Chin J Cancer Biother Apr. 2006 Vol. 13 No. 2 文章编号 1007-385X (2006) 02-0116-04论 著 地塞米松对前列腺癌 DU145 细胞 ERK1/2 活性和 cyclin D1 表达的影响 高庆贞1,吕家驹2,尉立京2,张 辉2,丁克家2(1. 山东大学临床医学院济南市中心医院血液净化中心, 济 南 250013; 2. 山东省立医院泌尿外科,济南 250021) 摘 要 目的:探讨糖皮质激素地塞米松抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞 DU145 的机制。方法:
2、通过细胞培养方法 观察地塞米松及其受体阻断剂 RU486 对前列腺癌 DU145 细胞增殖的作用; 采用流式细胞仪测定地塞米松对 DU145 细胞细胞 周期的影响; 利用 Western blot 技术检测 DU145 细胞受地塞米松作用后 cyclin D1 表达水平和 ERK1/2 活性的变化; 用 RT-PCR 技术检测 DU145 细胞中糖皮质激素受体 mRNA 的表达。结果:地塞米松明显抑制 DU145 细胞的增殖, 并且有剂量依赖效 应; 地塞米松使细胞周期阻滞于 G0/ G1期。Western blot 结果显示, 地塞米松作用 DU145 细胞 3 d 后, 细胞内 ERK1/
3、2 的活性 降低, cyclin D1 表达量下降。RU486 可以拮抗地塞米松对 DU145 细胞的作用效果。RT-PCR 结果显示 DU145 细胞有糖皮质 激素受体 mRNA 的表达。结论:地塞米松具有抑制前列腺癌 DU145 细胞增殖和阻滞细胞周期的作用, 此作用与其降低 ERK1/2 活性、 抑制 cyclin D1 合成有关, 提示糖皮质激素对前列腺癌的治疗有重要意义。 关键词 地塞米松;前列腺癌;细胞外信号调节激酶;细胞周期 中图分类号 R459. 1 文献标识码 A Effects of dexamethasone on ERK1/2 activity and cyclin D
4、1 expression in hu- man prostate cancer cell line DU145 GAO Qing-zhen1,L Jia-ju2,WEI Li-jing2,ZHANG Hui2,DING Ke-jia2(1. Blood Purification Center,Ji- nan Central Hospital,Shandong University,Jinan 250013,China; 2. Department of Urology,Shandong Pro- vincial Hospital,Shandong University,Jinan 250021
5、,China) Abstract Objective:To explore the mechanism by which dexamethasone inhibits androgen-independent prostate cancer cells. Methods:The effects of dexamethasone and RU486,a blocker of dexamethasone receptor,on DU145 cell growth were abserved. Flow cytometric analysis was performed to examine the
6、 effects of dexamethasone on cell cycle. Western blot analysis was employed to examine the effects of dexamethasone on extracellular signal-regulated kinase 1/2 activity and cyclin D1 expression in DU145 cells. Expression of glucocorticoid receptor gene mRNA was detected by re- verse transcriptase-p
7、olymerase chain reaction(RT-PCR) . Results:Dexamethasone dose dependently inhibited the growth of DU145 cell and caused cell arrest at G0/ G1stage. Western blot indicated that ERK 1/2 activity and cyclin D1 expres- sion were suppressed after 3 d culture with dexamethasone. The effects of dexamethaso
8、ne were blocked by RU486 when added simultaneously with dexamethasone. RT-PCR showed expression of glucocorticoid receptor mRNA in DU145 cells. Conclusion:Dexamethasone can suppress DU145 cell proliferation and cell cycle,possibly through the decreasing ERK1/2 activity and cyclin D1 expression,indic
9、ating glucocorticoid may have potential therapeutic effect on prostate cancer. Key words dexamethasone;prostate cancer;extracellular signal-regulated kinase;cell cycle Chin J Cancer Biother, 2006, 13 (2) : 116-119 作者简介 高庆贞 (1973 - ) ,男,山东苍山人,博士生,主要从 事泌尿系肿瘤基础与临床的研究 通讯作者 吕家驹,E-mail:kyoto2310 sina. com
10、 临床上糖皮质激素可以改善前列腺癌患者的一般 状况 1。以往认为这些作用与糖皮质激素提高代谢水 平、 增加食欲等作用有关。但近来发现糖皮质激素能 降低前列腺癌患者的前列腺特异性抗原 (prostate spe- cific antigen,PSA) 水平, 因此提示糖皮质激素能抑制 前列腺癌细胞增殖。目前对这种作用机制方面的研究 第 2 期高庆贞,等. 地塞米松对前列腺癌 DU145 细胞 ERK1/2 活性和 cyclin D1 表达的影响 不多。细胞外信号调节激酶 1/2 (extracellular signal- regulated kinase 1/2,ERK1/2) 信号传导通路是
11、生长因 子促进细胞增殖的主要通路, 此通路活性的变化对细 胞增殖有重要影响。本课题观察地塞米松对前列腺癌 DU145 细胞增殖和细胞周期的影响, 检测地塞米松作 用细胞后 ERK1/2 通路活性及细胞周期素 D1 (cyclin D1) 表达的变化, 以探讨地塞米松对前列腺癌的作用 机制。 1 材料与方法 1.1 试剂、 药物和细胞 前列腺癌 DU145 细胞购自中国科学院上海细胞 库;所 用 一 抗 包 括 cyclin D1 抗 体、总 ERK1/2 (t-ERK1/2) 抗体、 磷酸化 (活化的) ERK1/2 (p-ERK1, T202/ Y204; p-ERK2, T185/ Y18
12、7) 抗体和 -actin 抗体 均购自 R&D 公司 (Minneapolis, Minn. ) ; 辣根过氧化物 酶标记的二抗购自申能博采公司 (Shanghai,China) ; ECL 试剂购自美国 Santa Cruz 公司; 地塞米松和 RU486 购自 Sigma 公司 (Louis,MO) , 用少量乙醇溶解, 再用 F12K 基础培养基稀释到适当浓度。 1.2 细胞增殖测定 DU145 细胞在含有 10% 胎牛血清的 Hams F12K 培养液中 37、 5% CO2条件下生长。细胞接种于 24 孔板上, 每孔 104个细胞。细胞贴壁后以地塞米松干 预, 地塞米松终浓度为 0
13、、 10 -9、 10-8、 10-7、 10-6 mol/ L, 每组6 个复孔, 每2 d 更换1 次培养液, 7 d 后用胰酶消 化, 细胞计数, 观察地塞米松对 DU145 细胞增殖的剂 量效应。为了观察 RU486 对地塞米松的拮抗作用, 使 用 10 -7 mol/ L 的地塞米松和不同浓度的 RU486 干预 DU145 细胞, 观察它们对细胞增殖的影响。细胞增殖 抑制率 = (对照组细胞数 - 实验组细胞数) / 对照组细 胞数 100%。 1.3 细胞周期测定 DU145 细胞分为对照组、 地塞米松组 (终浓度 10 -7mol/ L) 和地塞米松 + RU486 组 (浓度
14、均为 10-7 mol/ L) , 培养 72 h 后收获各组细胞, 碘化丙啶染色, 用 流式细胞仪对 DNA 进行定量分析, 再结合计算机软件 推算各组细胞周期分布。 1.4 Western blot 检测 同上分组对细胞进行药物干预, 培养至贴壁面积 80% 90%时弃去培养液, 用 RIPA + PMSF 细胞裂解 液在冰上裂解细胞, 低温离心 5 min 提取蛋白, BCA 法 蛋白定量。加上样缓冲液, 60 变性 30 min。每孔 50 g 蛋白上样, 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳 产物转移至 PVDF 膜上。用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h, 加 一抗稀释液 (1:1
15、 000) 4过夜。TBST 洗膜, 置室温下 结合二抗 (1: 5 000) 1 h, TBST 洗膜。ECL 孵育 5 min, 暗室中压片显影。 1.6 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测 异硫氰酸胍一步法提取总 RNA, 逆转录合成 cD- NA, 在 EP 管中加入 cDNA 和目的基因的上下游引物 进行 PCR, 产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳, 置紫外灯下 观察照相。糖皮质激素受体上游引物: 5-TCCCTTTCT- CAACAGCAGGAT-3; 下游引物:5-CAATCATTCCTTC- CAGCACAT-3, 扩增产物 371 bp。 1.7 统计学处理 采用 SPS
16、S 13.0 软件包进行分析。均数的比较采 用 t 检验, 率的比较采用 x 2检验, P 0. 05 为差别有统 计学意义。 2 结 果 2.1 地塞米松对 DU145 细胞增殖的影响 细胞培养结果表明, 地塞米松显著抑制 DU145 细 胞增殖, 并且具有剂量依赖效应。浓度为 10 -7 mol/ L 的地 塞 米 松 对 DU145 细 胞 的 抑 制 率 为 (61. 9 12. 2) % (与对照组相比, P 0. 01) ; RU486 可以拮抗 地塞米松的增殖抑制作用, 在地塞米松 (10 -7mol/ L)+ RU486 (10-7mol/ L) 组, 其抑制率为 (46. 3
17、 6. 4) % (与 地塞米松组相比, P 0.05)(图 1) 。 图 1 地塞米松和 RU486 对 DU145 细胞增殖的影响 Fig. 1 Effects of dexamethasone and RU486 on DU145 cell proliferation *P 0. 01 vs Dex 0 group; *P 0. 05 vs Dex 100 mol/ L group 2.2 地塞米松对 DU145 细胞细胞周期的影响 流式细胞仪分析地塞米松作用 DU145 细胞后的 细胞周期变化。对照组 G0/ G1期细胞的百分率为 (68. 6 13. 4) %; 地塞米松组 G0/
18、G1期细胞比例上升到 (86.4 16.7) % (P 0. 05) 。由此说明, 地塞米松作 711 中国肿瘤生物治疗杂志第 13 卷 用 DU145 细胞后, 细胞周期被阻断于 G1期。等浓度 的 RU486 可以部分抵消地塞米松对细胞周期的影响, 该组细胞 G0/ G1期细胞比率为 (77. 2 19. 4) % (与地 塞米松组相比, P 0.05) 。 2.3 地塞米松抑制 DU145 细胞 ERK1/2 活性和 cyclin D1 表达 Western blot 结果表明, DU145 细胞表达 ERK1/2 蛋白和 cyclin D1 蛋白。在正常培养的情况下, 可检测 到磷酸化
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