培养的大鼠三叉神经节细胞钙激活钾通道的氧化性调节.pdf
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1、3 90 摘要 培养的大鼠三叉神经节细胞钙激活钾通道的氧化性调节 朱仲玲, 王 芳, 吴周环, 龙利红, 金悠, 陈建国 ( 华中科技大学同济医学院药理学系, 湖北 武汉4 3 0 0 3 0) 目的: 研究氧化还原药物对三叉神经节细胞离子通道的调节作用。方法: 记录氧化还原药 物对三叉神经节细胞大电 导钙激活 钾通道( B 玖、 ) 的影响。结果: 采用全细胞膜片钳电生理方法, 蛋氛酸特异性氧化剂c h l o r a ll l i n e- T(Ch一 T) l lnmol 几 可轻微增加通道电流幅值, 但该作用不能被半脱氨酸还原剂 1 , 4 一 dithi ,D L , t h r e
2、 i tol( D T I , ) 所逆 转。相反, 半脱氛酸特异性氧化剂5 , 5 气 ditl li 卜 b is( 2 一 ni trib enzo icac i d)( D T NB) 5 00拜 m O 1几降低B K 。 的电流幅值, 此 作用可被1 了 r l , 2 rruno I 几所逆转。结论: R ( ) 5 通过氧化调节B K 么 通道而参与三叉神经节细 胞的功能调节, B 民 ) 通 道在氧化应激相关性生理、 病理状态下起重要的调节作用。 关键词: 钙激活钾通道; 三叉神经节细胞; 氧化性调节; 蛋氨酸; 半胧氨酸 中图分类号: R96 5 . 2文献标识码: A文章
3、编号: 1 0 0 0 一 6 8 3 4 ( 2 0 0 6 ) 0 4 一 0 3 9 0 一 0 4 大电导钙激活钾通道( B 长、 ) 在很多组织中都 有表达, 在许多生理和病理过程中起到重要作用。 用免疫组织化学, Wes te m印迹和放射性配体结合 等 实 验 技 术, 已 证 实B K ca 在 脑 内 广 泛 表 达 。 B K 。 可促进动作电位后复极, 其主要功能是参与神经递 质的释放和病理生理状态下保护神经元避免出现钙 超载。B K ca因其大电导( Z o op s , 对称性 1 0 0 nirnol 几 K CI) , 钙敏感性, 电 压依赖性以及独特的药 理特性
4、而区别于其他的离子通道。细胞内钙和膜去 极 化 均可 激活B 呱通 道川。 许多 细 胞内、 外因 素可 调控B K 二 通道的 功能, 但研究多集中于蛋白 质磷酸 化的调节机制3, 对影响通道功能的重要因素 氧 化性调节的 机制 研究较 少川。 R o s 艰N s , 包括超 氧阴 离子( 饵 ) , 一氧化氮( N O ) 和过氧化氢( 玩q) 等通过氧化修饰各种蛋白质, 尤其是蛋白质中含琉 基( 一 S H ) 的氨基酸, 如半胧氨酸和蛋氨酸极易被各 种氧化剂所氧化, 从而与许多疾病如阿尔茨海默病 和帕金森病的进展有关。 B K 。 通道蛋白中含有大 量的半胧氨酸和蛋氨酸残基, 对各种
5、氧化剂敏感。 以往研究表明, 氧化还原剂调节表达在爪蟾卵母细 胞上51 。 通道门 控特性5 一 7 。本课题组前期研究亦 证明附属性俘 亚单位能增强对51 0 通道的氧化调节 作 用 “ , 但对原代培养细 胞上B 阮研 究较少, 因 此 本实验采用全细胞膜片钳技术, 研究氧化还原剂对 培养的大鼠 三叉神经节细胞B K 。 通道的调节作用。 ( Ch一 T ) , 5 , 5 一 二硫代双( 2 一 硝基) 苯甲酸( 1 ) 1 、N B ) , 氯化四乙胺( T E A , Cl) , 4 一 氨基毗陡( 4 一 A P ) 和氯化铬 ( CdClz) 均为51 脚a 公司产品。二硫苏糖醇
6、( D T I 、 ) 为Fl u ka公司产品。1 M E M一 F12 干粉培养基和胎 牛血清购于Gib co公司, 其余药品均为市售分析纯。 玻璃毛坯购于南京泉水教学实验器材厂。细胞外液 成分为( rn mol 几) : N aCl l 4 o 、 K C 1 5 、 C a C I: 2 、 M g C 12 1 . 2 、 H E P E S l o 、 D 一 G l u co sel o , p H7 . 4 。电 极内 液成 分( mmol /L) : K 一 G l u t arni n e l l o 、 K C 1 2 0 、 N 处 A l 、P3 、 E G T AO
7、 . 1 、 Mg C 1 2 3 、 H E I E S1 0 、 D-G l u cosel o , p H 7 . 2 。 1 . 2 主要实验仪器 膜 片钳放大器( A xo n 一 Z o o B , A x O nl n s t r u m e n t , U SA) , 微电极拉制仪( P P 一 8 3 , N a r i s h i g e , J a p a n ) , 倒 置相差显微镜( ix70, 01卿PuS ) , 三维显微操纵器 ( p CS 5 0 0 0 , B u r l e i g h , U SA ) , 数模转换器( I T C es 1 6 , I
8、n s t ru t e c h 6r 卯r a t io n , U SA) , Mac in t o s h 计算机。 1 . 3 大鼠三叉神经节细胞分离及培养 按参考文 献稍加修 改 ” 。 成年sD 大鼠( 雄性, 巧 。 一 2 5 0 9 , 由 华中 科技大学同济医学院实验动物 中心提供) , 迅速断头, 取双侧三叉神经节移入4 改良Han k 、 平衡盐溶液( H B SS) 中清除周围结缔组 织和血管, 用眼 科剪将组织剪碎, 然后移人含15 9 / L 胶原酶X l 一 5 型的H B SS 中37消化30 m in, 再加 1 材料与方法 1 . 1 药品与试剂 胶原酶(
9、 Xl一 5 ) , 1 N ase l( W) , N aZ A T p , 氯胺T 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目( 3 0 2 7 0 3 5 1 ) ; 回国人员 启动资金资助项目和教育部优秀青年教师资助项目。 收稿日 期: 2 0 0 5 一 0 2 一 1 7 ; 修回日期: 2 0 0 6 一 0 4 一 1 7 作者简介: 朱仲玲( 1 9 79一 ) , 女, 硕士在读, 从事神经药理学研 究。 乙 通讯 作者, E 一 mail : 。 h enJ mails . tj m u . e du. C n 中国应用生理学杂志, 2 0 0 6 ; 2 2 ( 4) 人2
10、0陷/m1 1 N as e l 继续消化10而n , 用含10% 热 灭活胎牛血清的D M E M一 F 12培养基终止消化, 8 00 r /1 n i n 离心s min , 弃去上清, 用D M E M-F 12培养基 清洗 2次, 然后加入含 10%热灭活胎牛血清的 D ME M-F 12培养基悬浮细胞, 用尖端热抛光的P as - te u r 吸管缓慢柔和吹打, 种植于 35 rnm培养皿, 放 人5 % C q 的培养箱中, 取培养12一24 h 的细胞用 于实验。 1 . 4 膜片钳记录 在倒置显微镜下选择膜表面光滑, 胞浆均匀, 形 态典型的三叉神经节细胞, 除了给予药物,
11、 始终用细 胞外液灌流细胞。玻璃电极用两步法拉制, 充灌电 极内液后电阻为 2 一SMn 。调节三维显微操纵器 使玻璃电极尖端与细胞表面接触, 负压吸引形成高 阻抗封接, 再稍加吸引使电极尖端膜片破裂, 形成全 细胞膜片钳记录方式, 记录电流前进行电容补偿和 串 联电阻补偿( 至少80%) 。 用P ul se / P ul se Fi t 电 信 号处理软件( H E K A, Germa ny) 对数据进行采集和分 析。所有实验均在20一24室温下进行。 幅 值, 给药前后电流幅值分别为( 4 . 63土 1 . 61) nA 和( 5 . 2 8 士 1 . 9 6) n A , 增加率
12、为1 5 . 3 4 %士 0 . 0 6 %( P 0 . 0 5 , n =7 ) , 用细胞外液冲洗和1 Tl , ZTnmol 几 均不能逆转Ch一 T对通道的作用( 图3 ) 。 尹摹氰 呻钾钾 守马若a与V 0一一 一月 习- 30一ZD一 I D01 O2 O: 洲J月 .506 0 2 结果 2 . 1 大鼠三叉神经节细胞B 吸知 通道电生理特性 保持电位一 80 m V, 为了使其他电压依赖性钾通 道失活, 首先给予0 1l l V5、 的预刺激, 然后给予从- 40 I n V到+ 60 m V的脉冲刺激, 阶跃电压为10 n 1 V ( 图I A ) , 引出一串幅值较大
13、, 快速激活, 几乎不失活 的外向电流( 图I B), 其电流幅度以零电流水平至除 极化末之间的电流大小表示。图I C 显示的是BK。 通道1 一 V关系曲线, 随着测试电压由一 40 Il l V向十 60 m V变化, B KC a 电流幅值不断增大, 并表现出外向 整流的特性。给予相对选择性的B K 。 通道阻断剂 一 一 长 二 d CI : 和T E A CI, 观察它们对B K 。 通道的作 用。细胞外液中加人 TEA 一 Cl lrnmo l 几 后, + 6 0 m V 测试电压处的电流幅值由( 6 . 09士 3 . 3 9)1卫 气 减小到( 2 . 39 士1 . 1 8
14、)1 卫 气 , 抑制率为 57. 88%士 9 . 9 8 %( P0 . 0 1 , n =7 , 图Z A ) 。加人 CdC 121 0 0 拌 mol 几, 同 样可 使B K 。 电流显著减小, 给药前后电 流 幅值分别为( 6 . 4 4 士 2 . 6 6 ) nA 和( 3 . 5 3 士1 . 3 6 ) nA, 抑制率为4 2 . 8 2 %士 1 1 . 5 1 %( P 0 . 0 1 , n = 6 , 图Z B ) 。 2 . 20 1 . T 对大鼠三叉神经细胞节B K d 通道的作用 Ch一 T是蛋氨酸特异性氧化剂。细胞外液中加 人Ch一 TI Tnmol 几
15、 可以轻微增加B K o 1通道的电流 V 。 随g e o u V ) F ig . IElec t r o p h y s io l呢1 司 p ro l erties ofB K oc l l a n n els in t l l g e n l i n alg a n g l lon neu rons A : B K Qc h ann e I c urrent s weree l ic i t edb y a dou b l e p 己 sep o t , col . Thell l 朗1 1 rane印t e n t ialw a shel da t一 8 0Il l Vandt h
16、 en s t e p p edt o p r ec ond i t iorun g volt 眼e s s p r ePu lseo f o n 1 V, f o 1 1o w e d b y a p p l ic a t iono f d e 阳l a r iz in g t e stpotent i a l s 5 0 0 rns in+1 01 1 】 V i n c r ement s f rom一 4 01l l Vu p t o+ 6 0 m V . B : T y p ic ally , a f 如 l y ofla r g , re l a t iv e noi s y ,
17、ra p id l y a c t ivat i飞, a n d a b ll s t non 一 in a c t i - vat i吧 o u twa r d c u rren t s was e l i c i t e d 勿t h e p 己 s e p 双 )tl 义 。 1 . C : 1 一 V r elat ionship s ofB K oc u rr ent s weres 】1 o w n A . . 一 一一 IC ont rol _ l soonA 匕 T EA一 C l lmmo l / L I O Oms Co n t r o C d C I , l 0() 协m
18、 o l / L soonA L 1 洲 ) m只 Fig . Z E fl ec tsol 1 、七 二 A es C I , 明C 贬and 4 一 A I J on l “ 从 、 C u rr e nt s A : B 长 勿 w asn l a r k e d l y s u p p ress e d 勿a p p l ica t ionl mxno l /LT E A Clby5 7 . 5 5 %士 9 . 9 5 %汕ent h e m e ll l b r ane 州e n t iald e 阳 lar - i z edt o+6 0m V( n =7 ) . B : C (
19、 IC 12 1 0 0拌 m O 1 /L not i c e 日 l y de- c r e a s 义 B K . 妞 c l l 赶 1l l n e l c u rr ent b y 4 2 . 8 2 %士1 1 . 5 1 %( n= 6 ) vi a in hi b it i吧 volt 眼已 de沐nde n tc a lc ium c 11 a 11 11 e 1swhe nt h emem - b rane因t ent i a l washeld a t + 6 01l l V 3 9 2 Co n tro l( 、一 T l mm理 、 1 厂 LW台 s h C h
20、i nJAI P l l v si ol 七fl l nJ八P P l rn y 别0 1 U U O;乙 乙、 斗) 2 2 ( 4 ) 立二 夏 -_一 叠垂豪_纂墓墓一 F i g . 3 E f f ec t ofC ll es Ton B K ocurrent w h en t h e l l e ll l l ra n e 户 又 ent i a l was h el da t+6 0m Vs l i g h t l yenhan c ement of t h e c u rren t s i n d u c edb y C h 一 Tl rnmol /L was not r ev
21、e rs ed e i t h e r b y ext ens i v e p erfu s ion orb y 日 p l l i c a t i on Zrnmol /I- I r厂1 、 2 . 3 D I ,N B 及D T I , 对大鼠三叉神经节细胞B 玫场 通 道的作用 1 ) 1 、 N B 是一种半胧氨酸特异性氧化剂。如图 4 A 所示, 细胞外液中 加人5 00拜 mol 几D ,N B 后, 从- 40m v到十 6 0 m v测试电压下, B K 。 电流明显减 小, 使B K ca 的 1 一 V曲线下移。在+ 60 1l l V刺激电压 处J 刀 ,N B 使B K
22、 。 电流幅值降低, 给药前后电流幅 值分别为( 6 . 6 7 士 1 . 4 2 ) nA 和( 4 . 2 9 士 1 . 0 9 ) nA( P 00 5 , n =1 1 ) , 抑制率为3 4 . 7 2 %士1 0 . 2 5 %。用细 胞外液冲洗不能逆转 1 p f N B对通道的抑制作用。 但半胧氨酸特异性还原剂1 Tl , Z rnmol 几 能完全逆 转1 ) 1 ,N B的作用( 图4 B ) 。 - . 一CO 】 1 廿0 1 闷 卜D T N 日s n 。, mo 巩 护 全 ,汤 材 工森幸 回回回00圈翻翻 A含)lu.自。 一 叨一 , 0 , 臼一1 二1
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- 培养 大鼠 三叉 神经节 细胞 激活 通道 氧化 调节
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