基于HEV中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究.pdf
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1、2 7 6 惫盅蠢篇煮潍恳蕊j 2 0 1 0 ,J u n ;2 9 ( 3 ) 2 7 6 2 8 0 2 7 6 J S o u t h e a s t U n i v ( M e d S c i E d i ) u 。_ 。、一7 一V 。 著 基于H E V 中和表位的基因免疫诱导 特异性抗体及中和作用研究 王春玲,杨书才,孟继鸿,王立新 ( 东南大学医学院病原生物学与免疫学系,江苏南京2 1 0 0 0 9 ) 摘要 目的:观察基于戊型肝炎病毒中和表位( p 1 7 9 ) 的基因免疫是否能在小鼠体内诱导具有中和作用的抗体 应答。方法:构建含H E V 中和表位p 1 7 9 编码
2、基因的真核表达质粒p V A x 一1 7 9 ,以肌肉注射法对B A L B c 小鼠实 施基因免疫,实验组每只小鼠给p V A x 一1 7 91 0 0 峭,并设立空质粒p V A x 和H E V - p 1 7 9 蛋白两个对照组。定期采 集小鼠血清,E L I S A 法检测其特异性抗H E V I g G 抗体及其亲合力;以基于P C R 的体外中和实验检测抗体的中 和活性。结果:p V A x - 1 7 9 质粒基因免疫诱导小鼠体内产生了特异性抗- H E V I g G 抗体,抗体水平于第1 0 周达高 峰,O D 值为0 5 5 0 1 3 ,与空质粒p V A x 组(
3、 0 1 5 0 0 7 ) 比较差异有统计学意义( P |口口 万方数据 王春玲,等基于H E V 中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究 2 7 9 2 4 p V A X - 1 7 9 基因免疫诱导抗体体外中和作用的 检测 采用R T n P C R 法确定了H E V 感染7 7 2 1 细胞的 最低感染滴度,结果如图4 A 显示:以1 0 、1 0 和 1 0 。3 稀释度病毒感染7 7 2 1 细胞均出现了阳性结果, R T n P C R 法扩增条带的大小与理论值( 2 3 6b p ) 吻合; 1 0 。4 稀释度病毒感染7 7 2 1 细胞呈阴性结果,该病毒悬 液的
4、最低感染滴度为1 0 。3 稀释度。 随后,采取l o o 倍的H E V 最低感染滴度的病毒稀 释度,即1 0 。1 稀释度病毒作为中和试验中的病毒使用 量,进行基于P C R 的体外中和试验,检测p V A X 1 7 9 基因免疫诱导抗体的中和活性。如图4 B 显示:p V A X 一 1 7 9 基因免疫诱导产生的特异性抗体能够在体外中和 H E V 病毒,阻止病毒感染7 7 2 l 细胞。提示基于中和 抗原表位p 1 7 9 的基因疫苗所诱导产生的特异性I g G 抗体具有保护性中和作用。 A H E V 感染7 7 2 1 细胞最低滴度的检测( 1 1 0 “稀释度病毒; 2 1
5、0 。2 稀释度病毒;3 1 0 。3 稀释度病毒;4 1 0 “稀释度病毒; 5 1 0 。稀释度病毒;6 1 0 “稀释度病毒;7 D N AM a r k e r ;8 含 H E V 的粪便悬液) ;B 体外中和实验检测p V A x 1 7 9 基因免疫 诱导抗体的中和活性 1 M a r k e r ;2 H E V ;3 M c A b ( 5 G 5 ) ;4 7 7 2 1 细胞;5 阴性血清;6 p V A x 组免疫血清;7 p V A x 1 7 9 组免疫血 清 图4p V A X 1 7 9 基因免疫诱导抗体体外中和活性的检测 n g4n 吐e c t i 彻0 f
6、 耻u t r a I :i z i n ga c t i v 畸f o ra n t i 。衄V 柚畸b 0 垭器 i n d u c e db yp V A X - 1 7 9 o d n 娟 3 讨论 H E V 基因疫苗大多以O R F 2 或O R 乃全基因序列 为基础,能诱导产生一定水平的具有保护作用的I g G 抗体- 。近几年来,随着对抗原蛋白的一级结构与空 间结构的深入研究,人们逐渐认识到全蛋白基因中含 有多种抗原表位( 包括中和表位和非中和表位) 及其他 调控序列、免疫抑制序列,而其他无关成分的存在会影 响目的抗原表位的免疫优势地位,因此,基因免疫由最 初的基于抗原全基因表
7、达载体阶段,发展到了基于抗 原表位的表达载体阶段。H E V O R F 2 和0 R F 3 存在多 个抗原表位以及中和性抗原表位刮。本室先前证实 的p 1 7 9 是能在真核细胞有效表达的、最短的、含中和 抗原表位的多肽( 位于O R F 2 编码蛋白第4 3 9 6 1 7 位 氨基酸) ,这为研制基于中和表位的H E V 基因疫苗奠 定了物质基础。 p V A x 质粒是美国F D A 首次批准能用于人体实 验的真核表达载体,以该质粒作为本项目的载体为日 后的实际应用提供便利,一旦实验成功可直接进入人 体实验,不必更换表达系统。在本研究中,我们将 H E V 。O R F 2 聊删7
8、( p 1 7 9 ) 编码基因克隆入p V A X 质粒 以构建p 1 7 9 真核表达载体,经过P C R 、D N A 序列分析 等确证,我们成功构建了p V A x 1 7 9 重组质粒。随后 以间接免疫荧光法检测证实,p V A x 一1 7 9 能够在体外 真核细胞中有效表达目的蛋白p 1 7 9 。以肌肉注射法 对B a l b c 小鼠实施基因免疫,结果发现,基于H E V 中 和表位p 1 7 9 的基因免疫能成功地在小鼠体内诱导产 生抗H E V 特异性的体液免疫应答,产生了H E V 特异 性I g G 抗体。 抗体的亲和力与其中和、清除病毒的活性密切相 关,也是评价基因
9、免疫效果的重要指标。本实验中,我 们采用N a s C N 竞争E L I S A 实验检测并比较了p V A x 1 7 9 基因免疫和重组蛋白p 1 7 9 免疫诱导抗体的亲合 力,结果发现,基因疫苗p V A X 一1 7 9 诱导产生的特异性 抗体亲合力较蛋白免疫组强,显示了基因疫苗p V A x 1 7 9 诱导的抗体亲和力成熟。B o y l e 等【9J 也在以模式 抗原为靶抗原的基因免疫研究中发现,以D N A 免疫的 方式诱导机体产生的特异性抗体亲和力较蛋白免疫组 强。其主要原因可能是基因免疫小鼠在免疫局部能持 续地表达低水平靶抗原,形成的抗原抗体复合物被输 送到淋巴滤泡,并
10、定位于F D C 表面,表达高亲和力 B c R 的B 细胞与抗原抗体复合物中的抗原结合,并在抗 原特异性的1 1 1 细胞辅助下增殖。产生高亲和力的抗体。 H E V 基因疫苗的核心问题是基因免疫诱导产生 的抗体是否对病毒感染具有中和作用。但是由于灵长 类动物模型价格昂贵、使用不便,H E V 体外感染细胞 尚未成功等原因,致使抗H E V 中和抗体及其保护作用 的检测难以深入。本研究中,我们采用基于P C R 的体 外中和实验检测了p V A X 一1 7 9 基因免疫诱导抗体的中 和活性口J ,结果显示,p V A X 一1 7 9 基因免疫诱导产生的 特异性抗体能够在体外中和H E V
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- 基于 HEV 中和 基因 免疫 诱导 特异性 抗体 作用 研究
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