大肠埃希菌DNA对小鼠抗IFNα免疫应答的增强作用.pdf
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1、大肠埃希菌 DNA 对小鼠抗 IFN-免疫应答的增强作用 李京培, 毕克菊, 王明丽 摘要 目的 探讨大肠埃希菌 (E. coli) DNA 对小鼠抗 IFN- 免疫增强的作用。方法 Balb/ c 纯系小鼠随机分成 8 组, 生 理盐水对照组 (A) ;E. coli DNA 50 g + IFN- 1. 0 g (B) ; 弗氏完全佐剂 + E. coli DNA + IFN- (25 g +25 g +1. 0 g)(C) ;弗氏完全佐剂 50 g + IFN- 1. 0 g (D) ; 不加任 何佐剂的 IFN- (E) ;E. coli DNA 12. 5 g + IFN- 1. 0
2、 g (F) ;E. coli DNA 50 g + IFN- 0. 25 g (G) ;E. coli DNA 12. 5 g + IFN- 0. 25 g (H) 。小鼠腹部皮下注射, 首次免 疫后加强免疫 2 次,用微量中和实验、 MTT 法和细胞流式技 术分别检测小鼠体液免疫和细胞免疫状态。结果 经组间 单因素相关性分析, E. coli DNA 和弗氏完全佐剂均能明显增 强小鼠特异的体液免疫和细胞免疫, 其中 E. coli DNA 刺激 IFN- 抗体剂量效应和脾淋巴细胞活性均与弗氏完全佐剂 相当 (P 0. 05) , 而 E. coli DNA 免疫后 IFN- 抗体的时效性
3、较弗氏完全佐剂效果好。结论 E. coli DNA 具有强烈的免 疫刺激作用, 可成为一种新型免疫佐剂。 主题词 埃希氏菌属;DNA,细菌;干扰素 ;小鼠 自由词 免疫增强;佐剂 ;弗氏完全佐剂 中图分类号 R 342;R 378. 99;R 392 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 (2006) 04 -0379 -04 2005 -11 -14 接收 基金项目: 合肥市科研计划项目 (编号: 合科合同农字 2004.5) 作者单位: 安徽医科大学微生物学教研室, 合肥 230032 作者简介: 李京培, 男, 44 岁, 高级实验师; 王明丽, 女, 50 岁, 教授, 硕士
4、导师, 责任作者, E-mail: wangmlli mail. hf. ah. cn 近来研究发现, 细菌的 DNA 中 CpG 基元即以 未甲基化的 CpG 二核苷酸为核心的特定寡核苷酸 序列 (oligonucleotide, ODN) 在细菌基因组中普遍存 在, 它既是脊椎动物免疫细胞特异性识别细菌 DNA (CpGDNA) 的结构基础, 也是细菌 DNA 具有广泛免 疫刺激作用的结构基础 1 -3。业已证明, 含有非甲 基化 CpG 基元的细菌 DNA 能刺激多种免疫细胞的 分化增殖 (如树突状细胞、NK 细胞和 B 细胞等) 并 激活 T 细胞的免疫功能, 诱生大量的细胞因子, 协
5、 同调节机体的先天性防御反应和获得性免疫反 应 4 -5。当前, 人们对病毒感染性疾病高度重视, 但 对病毒性防治方法和技术仍比较薄弱, 除常见的病 毒疫苗外, 大多数病毒感染宿主还没有有效的预防 措施, 如感染人类的 HIV 和人禽感染的流感病毒 等。临床常用一种高效纯化的生物制剂, 血源或重 组 interferon-aphe (IFN-) 是治疗病毒感染的一种有 效细胞因子, 而抗 IFN- 血清 (抗体) 是鉴别不同类 型干扰素的重要标志。本实验以纯化的 IFN- 为抗 原, 以大肠埃希菌 (E. coli)DNA 和 (或) 弗氏完全佐 剂为不同佐剂, 以比较不同佐剂对 IFN- 的
6、免疫增 强效果。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌种 E. coli (ATCC25922) 由本教研室保藏 菌种, 37培养于普通营养琼脂固体培养基上 20 24 h。 1. 1. 2 动物 Balb/ c 纯系小鼠 6 8 周龄, 体重 18 20 g, , 共 125 只, 由安徽医科大学实验动物中 心提供 (普通级) 。 1. 1. 3 主要试剂与仪器 溶菌酶、 饱和重蒸酚、 MTT 和 ConA 购于北京天象人生 物 医 学 公 司, DMEM 细胞培养基、 胰酶均为美国 GIBCO 公司产 品, 完全 DMEM 培养液 (DMEM 培养液加入 100 万 IU/
7、L 青霉素、 100 mg/ L 链霉素和 10% 小牛血清) , HCl 和异丙醇为北京化学试剂厂产品 (AR 级) , 碘 化丙啶、 RNaseA 由安徽省立医院朱明主任提供, 754 紫外分光光度计为上海第二分析仪器厂产品, 自动 酶标读数仪为美国 Bio-Tek 公司产品。 1.1. 4 免疫用 IFN- 的抗原 购自市售人 IFN 注 射剂 (a1b 和 a2b) 500 万 IU/ 支 (5 mg/ 支) , 批号 040901 (深圳科兴) 和批号 20040618 (安徽安科) 。 1. 2 方法 1.2. 1 佐剂的制备 弗氏完全佐剂按本教研室常 规方法配制, E. coli
8、 DNA 的制备与鉴定参照文献 6 收集培养菌体, 用溶菌酶和 SDS 裂解菌体, 饱和 酚氯仿抽提法去除菌体蛋白乙醇洗涤, 将纯化的 DNA 溶于无菌去离子水中, 用紫外分光光度计测 260 nm A 值作 DNA 定量, 280 nm 波长测定 A 值。 A260/ A280(1. 9。给 5 只小鼠分别腹腔注射 E. coli DNA, 500 g/ 只, 连续观察 7 d (应无不良反应) , 将 E. coli DNA 溶解于 pH 8. 0 的 TE 缓冲液中,-20 保存备用。 973安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 20
9、06 Aug; 41 (4) 1.2. 2 实验动物和不同佐剂分组 实验动物随机 分成 8 组, 各组佐剂用量。见表 1。 表 1 实验小鼠分组情况 组别n 组成成分剂量 A10生理盐水对照0.5 B25E. coli DNA 50 g + IFN- 1.0 g0.5 C10弗氏完全佐剂 25 g + E. coli DNA 25 g + IFN- 1.0 g0.5 D25弗氏完全佐剂 50 g + IFN- 1.0 g0.5 E25IFN- 1.0 g0.5 F10E. coli DNA 12.5 g + IFN- 1.0 g0.5 G10E. coli DNA 50 g + IFN- 0.
10、25 g0.5 H10E. coli DNA 12.5 g + IFN- 0.25 g0.5 用 E. coli DNA 和 (或) 弗氏完全佐剂与市售 IFN- 混合, 腹部皮下注射, 每只小鼠 0. 5 ml, 首次 免疫后 10 d 加强抗原免疫 1 次, 间隔 7 d 再加强抗 原免疫 1 次, 共 3 次。最后一次免疫 9 d 后采集每 只小鼠血样, 分离血清,-20冻存备用, 用来检测 IFN- 抗体, 同时取脾脏用 MTT 法和流式细胞计数 仪进行细胞分裂周期检测。在免疫接种结束后 3 d 开始采集小鼠血, 每隔 3 d 一次, 共 6 次, 每组每个 时段系统 3 只小鼠分离血
11、清, 待测抗体。 1. 2. 3 MTT 比色法检测 7 免疫小鼠采血后处 死, 无菌取出脾脏, 用组织匀浆器轻轻研磨, 离心 1 000 r/ min, 10 min, 弃去上清, 加 0. 83% NH4Cl 处 理红细胞, 室温 10 min, 离心1 000 r/ min, 10 min 弃 上清加 Hanks 液离心洗涤 2 次, 然后用 200 目网过 滤, 去除细胞碎片, 用含 10% 新生小牛血清的 DMEM 稀释细胞至浓度为 5 109/ L 的单细胞悬液。 加入 ConA 至每孔终浓度为 0. 005 mg/ L, 至 96 孔微 量细胞培养板内, 每个样本设 3 个复孔,
12、 5% CO2 37培养 48 h, 每孔加入浓度为 5 g/ L 的 MTT 液 10 l 继续培养 4 h, 每孔加入 0. 04 mol/ L HCl 的异丙 醇 150 l, 室温作用 10 min, 以酶联仪测定 A570值。 1.2. 4 脾淋巴细胞分裂周期检测 上述各组小鼠 脾细胞悬液用 70% 冷乙醇固定, 4 保存。具体染 色方法见文献 8 , 染色前 PBS 洗去固定液, 加 200 l RNaseA (1 g/ L) 37 水浴 30 min, 再加入 800l 碘化丙啶 (PI) 染色液混匀, 4 避光 30 min 上流式 细胞仪 (FACS-420 型) 进行淋巴细
13、胞周期检测。 1. 2. 5 微量中和试验检测 IFN- 抗体效价 参照 文献 8 -9 。 1. 2. 6 微量细胞病变抑制法检测 IFN- 抗原最小 保护剂量 (MID) 按常规滴定 IFN- 效价方法, 将 长满单层的 wish 细胞上清倒去, 稀释免疫用的 IFN- 抗原, 至 1 : 256, 然后在倍倍稀释至第 10 孔 1 : 0. 5 (IFN-) , 每个滴度 8 个复孔, 第 11 细胞对照, 第 12 孔病毒对照, 除细胞对照孔外, 每孔加入 200 个 TCID50VSV 0. 1 ml, 37 培养 24 48 h, 当病毒 对照孔镜下出现 75% 100% 细胞病变
14、时, 停止培 养倒去每孔液体, 每孔加结晶紫染色, 观察 100% 保 护细胞完整无损的最高稀释倍数, 即为 IFN- 的 MID。 1. 2. 7 微量 IFN- 中和抗体的检测 选用对数生 长期 wish 细胞, 经过消化吹打计数调整细胞为 109 个/ L, 每孔 0. 1ml, 再每孔加 0. 1 ml DMEM 的营养 液, 37 18 24 h, 镜下观察到细胞已形成单层细 胞, 将待检各组血清与阴性对照血清 56 灭活 30 min 后, 2 000 r/ min, 10 min 吸上清, 按 1 : 10 稀释 后, 再 2 倍稀释 (1 : 20 1 : 1 280) , 然
15、后每个稀释 孔血清与最小保护剂量 IFN- 等量混合 37作用 1 h, 每孔加上述混合液0. 1 ml, 每个浓度重复3 孔, 再 每个孔加入 200 个 TCID50VSV 病毒液, 该实验设细 胞对照孔, 病毒对照孔和 IFN- MID 对照孔和阳性 血清对照孔, 37 培养 24 48 h, 当病毒对照发现 完全细胞病变, 而细胞对照孔细胞生长旺盛呈单层 时, 终止培养倾去培养液, 加结晶紫染色5 min, 观察 结果, IFN- 抗体效价以 50% 细胞培养孔出现细胞 病变的血清最高稀释度表示按 Reed-Muench 计算中 和抗体效价。 1. 3 统计学处理 数据用%x s 表示
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- 大肠 埃希菌 DNA 小鼠 IFN 免疫 应答 增强 作用
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