天螺霜抑制2215细胞分泌HBSAG和HBEAG的实验研究.pdf
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1、天螺霜抑制 2215 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的实验研究 张 超1, 凌庆枝2, 刘群红1 (1. 安徽理工大学医学院,安徽 淮南 232001; 2. 合肥工业大学生物与食品工程学院, 安徽 合肥 230009) 收稿日期: 2005 -09 -24, 修回日期: 2005 -12 -18 基金项目: 安徽省教育厅自然科学研究资助项目 (No 2005KJ237) 作者简介: 张 超 (1962 - ) , 男, 副教授, 研究方向: 生物药品提取与 肝炎的治疗, Tel: 0554-6654135, E-mail:zhangchao9991 163. com Inhibiti
2、ve effects of tianluo- polysaccharide on HB- sAg and HBeAg of secretion in 2215 cell strain ZHANG Chao1,LING Qing-zhi2,LIU Qun-hong1 (1. Medical College,Anhui University of Science and Technolo- gy. Huainan 232001, China; 2. School of Biology and Food Engineering,Hefei University of Technology, Hefe
3、i 230009, China) 中国图书分类号: R 282. 74; R 284. 1; R 329. 2; R 373. 21; R 392. 11; R 735. 702; R 977. 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2006) 04 -0509 -02 关键词: 天螺多糖; 2215 细胞; 药物作用; 乙型肝炎病毒 Key words: tianluo-polysaccharide; 2215 cell line; drug effect; hepatitis B virus 天螺霜是我院通过对民间方剂 “天螺汤” 有效成分分 析, 首次以天螺 (江西巴
4、蜗牛, Bradybaena. Jiangxinensis) 为 原料采用溶剂提取法制取的多糖类生物活性物质 1。本研 究以 HBV 转染的人肝癌细胞 (Hep G2) 2215 细胞株为靶细 胞, 拟通过体外细胞培养实验观察其对 HBV 分泌 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用及其细胞毒性。 1 材料和方法 1. 1 材料与仪器 天螺霜由本实验室自制 1 (白色颗粒状 结晶, 纯度 89. 16%, 室温下 10 h 硫酸-苯酚法吸收度 Rsd = 1. 47) , 4保存; HBV-DNA 转染人肝癌细胞 2215 细胞系引 自中 国 医 学 科 学 院 生 物 技 术 研 究 所。C
5、O2培 养 箱 (MCO15A, 日本三洋) ; 自动 免疫计数仪 (XH-6010, 国营西 安二六二厂) 。Eagles MEM 培养基 (美国 Gibco 公司) ; 胎牛 血清 (美国 Hyclone Lab 公司) ; G-418 (Geneticin, 美国 Gibco 公司) ; 四甲基偶氮唑盐 (MTT, 美国 Sigma 公司) ; 固相放射 免疫测定试剂盒 (中国同位素公司北方免疫试剂研究所) 。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 细胞培养 2 在长满 2215 细胞的培养瓶内加 0. 25%胰酶 37消化 3 min, 加培养液吹打, 1 : 3 传代, 10 d 长满
6、。取生长良好状态的 2215 细胞, 配制成 1 108L -1的 细胞悬液, 每孔1 ml 接种于24 孔细胞培养板, 37、 5% CO2 培养 48 h 后, 换用含不同浓度 (160、 80、 40、 20、 10 mgL -1) 天螺霜的培养液, 每浓度加 4 孔, 37、 5% CO2培养, 每 3 d 更换新鲜含药培养液, 共 2 次。8 d 后收集上清液, -20保 存, 检测 HBsAg 和 HBeAg, 并测定药物的细胞毒性。试验设 HBsAg、 HBeAg 阳性和阴性对照、 细胞对照各 3 孔。 1. 2. 2 细胞毒性试验 采用 MTT 法 3。于去除上清液的 细胞中加
7、入400 mgL -1 MTT 每孔0. 1 ml, 37、 5% CO2孵 育 4 h, 可见黄黑色甲“颗粒。弃去 MTT 液, 加入100% DM- SO 0. 1 mlwell -1, 待甲“颗粒完全溶解 (约 10 min) 后, 用 紫外分光光度计测光密度 A595、 A650。空白对照加4 孔100% DMSO 0. 1 mlwell -1。计算细胞存活率和天螺霜的半数毒 性浓度 (TC50) 。 1. 2. 3 HBsAg 和 HBeAg 抑制率测定 上清液中 HBsAg、 HBeAg 检测采用固相放射免疫法, 按说明书所示方法进行, 用 免疫计数仪测定每孔 cpm 值。计算细胞
8、对照及每药物 浓度下的 cpm 均值 (-x) 、 标准差 (s) 和药物对抗原的半数抑 制浓度 (IC50) 。 1. 2. 4 抗 HBV 活性评价 采用治疗指数 (TI) , TI = TC50/ IC50。当 TI 2 时, 药物高效低毒。TI 越大, 表明药物对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用越强, 细胞毒性越小。 2 结果 天螺多糖在体外细胞培养过程中可抑制 2215 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg, 且无细胞毒性。见 Tab 1。 Tab 1 Inhititive effects of tianluo-polysaccharide on HBsAg and HBeA
9、g of secretion and its cytotoxicity (n =4) Drug concentration /mgL -1 HBsAg Inhibitive / % IC50TI HBeAg Inhibitive / % IC50TI Cellar survival rate/ % TC50 16071. 343. 73. 188. 039. 8 4. 02 97. 4* 8066. 178. 499. 1 4042. 857. 1101. 2 2036. 626. 3100 1011. 03. 6100 *no cytotoxicity 3 讨论 研究表明, HBV 复制与共
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