大鼠血小板杀菌活性研究.pdf
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1、8 4 8 J o 二N A 己F 品A 志l 菇D I C 惹。u 赢E 蕊T Y 2 0 0 8D e c ;2 5 ( 6 ) 8 4 8 J O U R N A Lo FG U A N G X lM E D I C A LU N I V E R S I T Y 大鼠血小板杀菌活性研究* 李艳梁宁生刘滔滔1陆益黄天文雷宇潘文 ( 广西医科大学附属肿瘤医院药剂科南宁5 3 0 0 2 1 ) 摘要目的:探讨血小板在宿主防御细菌感染中的作用。方法:W i s t a r 大鼠麻醉后腹主动脉取血,离心分离出富血小板血浆 ( P R P ) ,从P R P 中分离血小板,以不同的诱导剂 凝血酶、
2、二磷酸腺背( A D P ) 和肾卜腺素( A D ) 分别诱导血小板及P R P ,观察其 杀菌活性。结果:分别经A D P 、A D 刺激的P R P 和血小板均无杀菌作用,而血小板和P R P 经凝血酶刺激后,均具有较强杀灭革 兰阳性( G + ) 细菌的作用。但对革兰阴性( G 一) 细菌却无杀灭作用。结论:大鼠血小板经诱导的可释放杀菌物质,在机体防御细 菌感染时发挥重要的作用。 关键词大鼠;血小板;杀菌活性 中图分类号:R 一3 3 2文献标志码:A文章编号:l 0 0 5 9 3 0 X ( 2 0 0 8 ) 0 6 一0 8 4 8 一0 3 S T U D I E So FB
3、 A C T E R I C I D A LA C T l V I T I E So FP L A T E L E TF R o MR A T L iY a n ,l 。i a n gN i n g s h e n g ,L i uT a o t a o ,e ta 1 ( D c p a r t m e n to fP h a r m a c y ,t h eA f f i l i a t e dT u m o rH o s p i t a lo f G u a n g x iM c d i c a lU n i v e r s i t y ,N a n n i n g5 3 0 0 21C
4、 h i n a ) A b s t r a c to b j e c t i v e :T oe x p l o r et h er o l eo fr a tp l a t e l e ti nh o s td e f e n s eb a c t e “ai n f e c t i o n M e t h o d s :B l o o d w a sc o l l e c t e df r o mW i s t a rr a t s T h eb l o o dw a sc e n t r i f u g e dt op r e p a r ep l a t e I e t r i c
5、hp l a s m a ( P R P ) ,t h ep l a t e l e t sw e r et h e np c l l e t e df r o mp l a s m ab yc e n t r i f u g a t i o n T h ep I a t e l e ta n dP R Pw e r es t i m u l a t e db ys e v e r a la g e n t s ( t h r o m b i n ,a d e n o s i n ed i p h o s p h a t ea n da d r e n a l i n eh y d r o c
6、 h l a r i d e ) ,a n dt h e nt h eb a c t e r i c i d a la c t i v i t i e s w e r ed e t e r m i n e db yc o u n t i n gb a c t e r i a lc o l o n yf o r m e du n i t ( C F U ) a f t e ri n c u b a t i o nf o r2ha t3 7 a n dt h e b a c t e r i c i d a lr a t ec a l c u l a t e d R e s u l t :P l a
7、 t e l e ta n dP R Pu p o ns t i m u I a t i e db ya d e n o s i n ed i p h o s p h a t e ( A D P ) a n d a d r e n a l i n ( A D ) d i dn o ts h o wb a c t e r i c i d a l P l a t e l e ta n dP R Ps t i m u I a t i e dw i t ht h r o m b i nh a dp o t e n tb a c t e r i c i d a la c t i v i t yt o w
8、 a r dG r a n l _ p o s i t i v e ( G + ) b a c t e r i a ,b u tn oe f f e c to nG r a m n e g a t i v e ( G 一) b a c t e r i a C o n c h I - s i o n :R a tp l a t e l e tw i t ht h r o m b i n i n d u c e dc a nr e l e a s ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sa n dp l a ya ni m p o r t a n tr o
9、 l ei n h o s td e f e n s ea g a i n s tb a c t e “ai n f e c t i o n K e yw o r d sr a t ;p l a t e l e t ;b a c t e r i c i d a la c t i v i t y 血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆裂解脱落下来的 小块胞质,是血液中最小的颗粒成分,它在机体的主要生理 功能是参与正常止血,在病理情况下参与血栓形成 1 2 】。目 前对于血小板的研究主要围绕其功能止皿和血栓展 开 2 。而作为机体防御体系中的一部分,血小板在防御细胞 感染和杀菌方面的作用很少被注意到,最
10、新的生理教科书L 1 1 也未曾提及。有学者从血小板中分离提纯出的蛋白多肽具 有杀菌的功能,但利用血小板直接进行杀菌试验的研究却未 见报道。为此该研究进行了血小板分离,并使用凝血酶、二 磷酸腺苷( A d e n o s i n ed i p h o s p h a t e ,A D P ) 和肾| :腺素( A d r e n a I i n ,A D ) 诱导剂刺激血小板使其释放物质、并进行杀菌实 验。现将结果报道如下。 * 基金项目;广西医疗卫生重点科研课题( N o 重2 0 0 7 0 7 ) l 广西科学基 金资助项目( N o 桂科回0 6 3 9 0 2 6 ) l 广西医科大
11、学第一附属医院 通信作者,E m a i l :l i a n g n o l 1 6 3 c o m 收稿日期:2 0 0 7 一1 1 1 2 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物:W i s t a r 大鼠2 0 只,清洁型,雌雄各半,体 重( 4 0 0 士5 0 ) g ,由广西医科大学实验动物中心提供。 1 1 2细菌:金黄色葡萄球菌标准菌株( A T C C 2 5 9 2 3 ) 、大肠 杆菌标准菌株( A T C c 2 5 9 2 2 ) 购自中国生物制品鉴定所,耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌菌株( m e t i c i l l i n - r e s i s
12、 t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ,M R s A ) 、粪肠球菌菌株,枯草杆菌菌株为广西医 科大学第一附属医院检验科分离鉴定。 1 1 3 试剂:R P M l l 6 4 0 为G I B C o B R L 公司产品,H e p e s 为 S i g m a 公司产品,凝血酶( 2 0 0 U 支) 为昆明白马制药厂生产, A D P 为A M R E s C o 生产,上海生工每物T 程有限公司分装, A D ( 1 m g m L ) 为天津氨基酸公司人民制药厂产品,其余试 剂均为分析纯。 1 2 方法 1 2 1 血小板
13、分离及刺激实验 3 :大鼠乙醚麻醉后腹主动 脉取血,以3 8 枸橼酸钠:全血一1 :9 抗凝,2 2 18 0 0 r m i n 1 0m i n 离心,上层即为富血小板血浆( p r e p a r ep I a t e l e t r i c hp l a s m a ,P R P ) 。将P R P 在显微镜下进行血小板计 万方数据 李艳,等大鼠血小板杀菌活性研究 8 4 9 数,约为3 5 1 0 s m L 。将P R P 与枸橼酸葡萄糖混合液( 6 5 m m o l L 枸橼酸8 5m m o l L 枸橼酸钠,2 葡萄糖) l :5 混 合,2 2 1 2o o or m i
14、 n 1 0m i n 离心,上清液即为血浆,下层 沉淀物即为血小板。重悬血小板于H e p e s 缓冲液( 1 3 7 m m o l LN a C l ,2 7m m o l 1 K C l 。1 0m m o l LH e p e s ,o 1 葡 萄糖。p H 7 4 ) 中。镜检计数,调整血小板浓度为2 1 0 9 m I ,。 在血小板、H e p e s 缓冲液、P R P 和血浆样晶中分别加入诱导 剂( 凝血酶终浓度l oU m L 、A D P 终浓度5f I m o l L 、A D 终浓 度1 0P g m L ) ,3 7 水浴1 0m i n ,4 1 2O o o
15、r m i n 1 0m i n 离心,取上清液进行杀菌实验,血小板和缓冲液组需加入 5m m o l L C a 2 。 1 2 2 杀菌实验:实验组用诱导剂刺激过的血小板、P R P 、血 浆进行杀菌实验,对照组不加诱导剂。同时用诱导剂刺激 H e p e s 缓冲液,观察诱导剂本身有无杀菌作用。杀菌活性测 定方法4 j :将样品9 5 肛L 与细菌5 弘L ( 终浓度1 1 0 6 m I ) 混 合,3 7 水浴2h 。取5 0 弘L 反应液加入4 5 0p L 的生理盐水 1 0 倍稀释,连续稀释4 次。每一次稀释都取出1 0 0P L 的稀 释液至无菌培养皿中,加入经高温消毒后5
16、5 保温的琼脂 培养基约5m L ,待琼脂冷却后,将培养皿放入约3 7 温箱培 养。1 8 2 4h 后取出数细菌菌落形成数目( C F U ) 。计算杀 菌率= ( 对照组C F U 一实验组C F U ) 对照组C F U l o o 。 2 结果 2 1 凝血酶( 终浓度1 0U m L ) 、A D P ( 终浓度5 弘m o l I 。) , A D ( 终浓度1 0 弘g m L ) 刺激H e p e s 缓冲液均无杀菌作用,说 明这些诱导剂自身无杀菌作用。 2 2 分别经A D P 、A D 刺激的P R P 和血小板均无杀菌作用。 2 3 经凝血酶刺激的P R P 、血小板对
17、G + 菌具有较强的杀菌 活性。经凝血酶刺激的P R P ( 血小板数3 5 1 0 8 m L ) 对金 葡菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草杆菌、M R S A 作用2h 后 的杀菌率均在9 5 9 9 ,经凝血酶刺激的血小板( 血小板 数3 5 1 0 8 m L ) 对上述细菌杀菌率在9 0 9 7 ,经凝血 酶刺激的血浆对G + 菌有弱的杀菌活性,杀菌率为2 0 3 0 。经凝血酶刺激的血小板、P R P 、血浆对大肠杆菌( G 一 菌) 均无作用,见图l 。 ABCDEF 图1P R P 和血小板的杀菌活性 A :金黄色葡萄球菌B :表皮葡萄球菌C :粪肠球菌 D :枯草杆菌E :M
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