大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定.pdf
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1、查堕堕笪丛茎查! 墅堡! 旦蔓望鲞箜堡塑丛型堕曼堂苎苎璺坐些鱼坠地竺型堕塑! ! 尘! ! 坚! ! 垡:望! 塑! :1 2 3 9 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养 纯化与鉴定* 卢仁荣一陈良龙 江琼 郭进建 基础研究 摘要】 目的:探讨骨髓间充质干细胞( B M S C s ) 体外获取及培养增殖的方法并鉴定。方法:用密度 梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化培养大鼠B M S C s ,测定生长曲线,流式细胞仪鉴定,免疫细胞化学 检测。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠B M S C s ,P 2 。代细胞生长曲线基本一致, 增值能力强,呈均一成纤维样细胞,P 3 代以后细
2、胞均一地表达细胞表面抗原C D 4 4 、C D 9 0 ,不表达C D 3 4 , 弱表达C D I l b e ,细胞表达C o n n e x i n 4 3 。结论:本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠B M S C s 的方法, 培养的细胞成分单一,适用于对B M S C s 进一步的应用研究。 ( 关键词】骨髓间充质干细胞;连接蛋白4 3 ;动物实验,大鼠 中图分类号】Q 8 1 3 1 文献标识码 A 文章编号】1 0 0 7 5 0 6 2 ( 2 0 0 8 ) 0 4 2 3 9 0 4 I s o l a t i o n - c u l t u r e 。p u r i
3、f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr a tb o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s L UR e w o n g ,C H E N L i a n g l o n g ,J I A N G 增,G U OJ i n j i a n D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y ,A f f i l i a t e dS a n m i n gF i r s tH o s p i t a lo f ,l 扣n M e d i c a lU n
4、i v e r s i t y 。S a n m i n g ,F 咖n3 6 5 0 0 0 ,C h i n a 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e :T oe x p l o r ea ni nv i t r op r a c t i c a lm e t h o do ft h ei s o l a t i o n ,c u l t u r ea n dp u r i f i c a t i o no fb o n e m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( B M S C s ) f r o mt h eb
5、o n em a 肿wo ft h ea d u l tr a t s ,a n dt oi d e n t i f yt h e m M e t h o d :B M S C sw e r e i s o l a t e dw i t hd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na n da d h e r e n tc u l t u r ef r o mt h eb o n en l a l T O wo ft h ey o u n gS Dr a t s C C K - 8 r e a g e n tW a Su s
6、e dt od e t e r m i n et h eg r o w t hc u r v e L i g h tm i c r o s c o p e sw e r eu s e dt Os t u d yt h em o r p h o l o g i cR ,a t u r 屯8 F l o w c y t o m e t r yw 曲a p p l i e dt oi d e n t i f yt h ec e l l s I m m u n o c y t o c h e m i s t r yt e c h n i q u ew a ge m p l o y e dt Oe x
7、a m i n et h ec e l la n t i g e n s o fc o n n e x i n 4 3 R e s u l t :T h ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nc o m b i n e da d h e r e n tc u l t u r eC a ni s o l a t ea n dp u r i f yB M S C s e f f i c i e n t l y T h es i m i l a rg r o w t hc u r v e so fp a s s a g e 2
8、 、4a n d6w e r ee x h i b i t i n gal a r g ee x p a n s i v ep o t e n t i a la n dt h et y p i c a l f i b m b l a s t - l i k em o r p h o l o g y T h eB M S C sa r eu n i f o r m l ye x p r e s s i n gC I M 4 ,C D g O ,a n dw e a H ye x p r e s s i n gC D llb c ,a n d n o te x p r e s s i n gC D
9、 3 4a f t e rp l I s s a g e3 C o n n e x i n 4 3a r ep o s i t i v ei nc e l l s C o n c l u s i o n :A ni n v i t r om e t h o df o rt h e i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fB M S C sf r o mr a tb o n en H I n 口wh a sb e e ne s t a b l i s h e d T h ec u l t u r e dc e l l sw e r eo n
10、 l yc o m p o s e d o fu n d i f f e r e n t i a t e dB M S C s K e yw o r d s B o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ;C o r m e x i n 4 3 ;A n i m a lL a b o r a t o r y ,r a t 目前在细胞性心肌成形术中,移植使用的细胞 包括骨骼肌成肌细胞,血管平滑肌细胞,造血干细胞 和骨髓间充质干细胞( b o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s , B M S C s ) 五
11、J 。其中B M S C s 具有多潜能性、自体来源、 增生能力强和体外基因转染率高等优点而更适合于 临床应用。但骨髓中B M S C s 的含量非常少,必需在 基金项目:福建医科大学科研发展基金( F J G X Y 0 4 0 1 6 ) 作者单位:3 6 5 0 0 0 福建医科大学附属三明第一医院心内科( 卢仁 荣) 福建医科大学附属协和医院心内科福建省冠心病研究所( 陈良 龙江琼) 福建省人民医院心内科( 郭进建) 现工作单位:福建医科大学附属三明市第一医院心内科 通讯作者 体外分离纯化、培养扩增才能满足要求。本实验对 成体大鼠B M S C s 进行了分离、培养和免疫细胞化学 检测
12、,并对其细胞学特性、表型特征进行研究,为进 一步探讨B M S C s 在细胞性心肌成形术中的应用提 供基础。 资料与方法 S D 大鼠,体质量约1 5 0 1 8 0g ,雌雄不限,福建 医科大学实验动物中心提供。 淋巴细胞分离液( 华美) ,低糖型D M E M 干粉培 养基、新生牛血清( G I B C O ) ,胰蛋白酶( S i g m aU S A ) , C C K - 8 试剂( D o j i n d o ) ,兔抗大鼠单抗C o n n e 【i n 4 3 万方数据 2 4 0 :坚堕查筻塞盘查! 塑! 生! 旦箜! ! 鲞笙! 塑! 婴型堕鱼! 蔓i 型! 竺些些壁坠墅
13、! ! ! 空里i ! 垫苎! ! ! ! z ! 塑! ! ! 堂:望! 塑! :兰 ( Z y m e d ) ,S P 免疫组化试剂盒( 北京中山) ,小鼠抗大 鼠单抗C D 4 4 P E 、C D 9 0 P E 、C D 3 4 一F I T C 和C D l l b c F I T C ,小鼠I g G l 一P E 、I g G 2 。- P E 、I g G I - F I T C 和I g G 2 。一F I T C ( B e c k m a nc o u l t e r ) 。流式细胞仪( C O U L T E RE P I C SX L 型) ,酶标仪( B i o
14、 R A D 型5 5 0 ) ,倒置生物显微镜 ( x s J D 2 ) ,C O ,恒温培养箱( 2 3 0 0 型S H E I L A B ) ,透 射电镜( 日立H u 1 2 A ) ,计算机显微成像系统 ( O l y m p u sP M I O S P ) 。 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化和扩 增取1 个月龄S D 大鼠,腹腔注射氯氨酮过度麻醉 致死,分离股骨、胫骨,用D M E M 培养基冲出骨髓, 吸管反复吹打成细胞悬液。加入等体积的1 0 7 7 g m E 淋巴细胞分离液20 0 0r p m 离心2 0m i n ,吸取中 间的白膜层,5m LD M E
15、 M 重悬浮,10 0 0r p m 离心1 0 m i n ,弃上清,共2 次,用含1 2 N C S 的D M E M 调整成 2 l 驴c e l l s I I l I 洧核细胞培养液,接种于2 5m L 培养瓶 中,置于3 7 ,5 C 0 2 ,饱和湿度的培养箱中培养。 2 4h 首次换液,以后每3 。4d 换液一次,每日在倒置 显微镜下观察细胞的形态及生长情况。待细胞融合 8 0 时,用0 1 2 5 胰蛋白酶消化,1 :2 3 传代。 细胞生长曲线取生长良好的P 2 代细胞消化 制备单细胞悬液,以1 1 0 m L 接种于1 0 块9 6 孔 培养板,每板接种3 孔,每孔0 1
16、m L ,置于培养箱中 培养。另准备几个孔接种已知数量的活细胞进行标 定。从次日起每日随机选取1 个培养板,每孔加入 1 0 止的C C K 8 后放人培养箱培养1 4h ,用酶标仪 在4 5 0n m 波长处测定吸光度,参比波长6 3 0n m ,用 接种在孔中已知数量活细胞所测得的吸光度制备一 个表达曲线。取各时相点吸光度的平均值,以时间 ( d ) 为横坐标,吸光度( 表示细胞相对数量) 为纵坐 标,绘制生长曲线。同法培养并绘制P 4 、P 6 代 B M S C s 的生长曲线。计算群体倍增时间T D ,根据对 数生长期生长曲线始末两点之间A 值的变化,按照 以下公式计算细胞相对A 值
17、的倍增时间:D T = t 1 9 2 ( 1 9 N t l g N o ) ,其中t 代表细胞培养时间,N t 代 表培养后的吸光度,N o 代表培养前吸光度。 细胞表面标记物的检测取达到8 0 9 0 融合后的P 3 代细胞,用0 1 2 5 胰蛋白酶消化,P B S 洗涤1 2 遍,用P B S 制成2 l O 个细胞m L 的悬 液,经3 0 0 目的尼龙网滤过。将细胞悬液分装至8 只1 5m L 的E P 管中,分别加入C D 9 0 P E 、C D 3 4 F I T C 、C D 4 4 P E 、C D l l b c F I T C 及其同型对照各1 0 m ,3 7 下
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