姜黄素对爪蟾卵母细胞表达人低密度脂蛋白受体的影响.pdf
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1、基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (N o . 3 0 0 7 0 9 3 2) , 浙江省中 医药科研基金项目 (N o . 2 0 0 3 C 0 1 3) 作者单位: 1 .浙江中医学院生命科学系 (杭州3 1 0 0 5 3) ;2 .杭州师 范学院生物化学教研室 通讯作者: 范春雷, T e l:0 5 7 1 - 8 6 6 1 3 6 2 5,F a x:0 5 7 1 - 8 6 6 1 3 5 9 8, E - m a i l:s n o w z j t c m. n e t 姜黄素对爪蟾卵母细胞表达人低密度脂蛋白 受体的影响 范春雷1沃兴德1罗艳2卢德赵1钱颖1 摘要目
2、的在爪蟾卵母细胞中建立人低密度脂蛋白受体 (l o wd e n s i t y l i p o p r o t e i nr e c e p t o r,L D L - R) 表 达系统, 并研究姜黄素降脂作用的分子机理。方法将含人L D L - R的表达质粒p 3 . 7L D L导入细胞核中, 用免疫荧光、 配体荧光以及免疫胶体金标记透射电镜等方法检测细胞膜上L D L - R的表达情况; 用不同浓度 的姜黄素对爪蟾卵母细胞人L D L - R基因的表达进行干预, 并用酶联免疫吸附分析法测定L D L - R的表达量。 结果人L D L - R基因在爪蟾卵母细胞膜上得到表达; 姜黄素具有
3、增强其表达的作用, 且有明显的量效关系。 结论姜黄素降血脂和抗动脉粥样硬化的作用途径之一可以是通过促进L D L - R基因的表达, 增加细胞对低 密度脂蛋白胆固醇的吸收, 从而降低血清胆固醇。 关键词姜黄素; 爪蟾卵母细胞; 基因表达; 低密度脂蛋白受体; 血脂 E f f e c t o fC u r c u L i no nE x p r e s s i o no fH u L a nL o wD e n s i t yL i p o p r o t e i nR e c e p t o r s i nX e n o p u sL a e v i sO o c y t e s F A N
4、C h u n - l e i,WOX i n g - d e,L U OY a n,e t a lD e p a r t m e n t o fL i f eS c i e n c e,Z h e j i a n gC o l l e g e o fT r a d i t i o n a l C h i n e s eM e d i c i n e,H a n g z h o u(3 1 0 0 5 3) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h em o l e c u l a rm e c h a n
5、i s mo f c u r c u m i n i nr e d u c i n gb l o o d l i p i d sb ye s - t a b l i s h i n gg e n ee x p r e s s i o ns y s t e mo fh u m a nl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r s(L D L - R)i nX e n o p u sL a e v i s o o c y t e s (X L O) .M e t h o d s T h e e x p r e s s i o no
6、fL D L - Ro nc y t o m e m b r a n ew a sd e t e r m i n e du s i n g i m m u n o - f l u o r e s - c e n t,l i g a n d - f l u o r e s c e n t a n d i m m u n e c o l l o i d a l g o l d t e c h n i q u e s a f t e r h u m a nL D L - Rc o n t a i n i n gp 3 . 7L D Lp l a s m i d w a s l e d i n t o
7、n u c l e u s . A n d t h e e x p r e s s i o no fL D L - Rg e n e i nX L Ow a s q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e db yE L I S Aa f t e r b e i n g i n t e r f e r e dw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c u r c u m i n . R e s u l t s T h e h u m a nL D L - Rg e n e c
8、 o u l d b e e x p r e s s e d o nX L O,w h i c hc o u l db e s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e db yc u r c u m i n i nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r . C o n c l u s i o n O n eo f t h ep a t h s o f c u r c u m i n i n r e d u c i n g b l o o d l i p i d s a n d a n t i - a t h e r o
9、s c l e r o s i sw a s i m p r o v i n gL D L - Rg e n e e x p r e s s i o n a n d i n c r e a s i n g t h eL D L - c h o l e s t e r o l a b s o r p t i o no f c e l l s . K e yw o r d s c u r c u m i n;X e n o p u sL a e v i so o c y t e s;g e n ee x p r e s s i o n;l o wd e n s i t y l i p o p r
10、o t e i nr e c e p t o r;b l o o d l i p i d s 从2 0世纪8 0年代起我们对中药姜黄中经醇提后 得到的总姜黄素进行了大量实验, 发现姜黄素除具有 较强的抗氧化、 抗感染、 抗炎、 抗凝、 抗肿瘤作用外, 能 显著地降低血清总胆固醇 (T C) 、 甘油三酯 (T G) 、 低密 度脂蛋白胆固醇 (L D L - C) 和载脂蛋白B - 1 0 0(A p o B - 1 0 0) , 能抑制平滑肌细胞增殖, 抑制氧化修饰L D L促 平滑肌细胞增殖和氧化L D L诱导的平滑肌细胞凋亡 等作用 1 。姜黄素还可能通过促进肝、 肾上腺对L D L 的
11、代谢, 增加胆囊对L D L排泄, 抑制脾对L D L的摄 取, 从而起到降血脂和抗动脉粥样硬化作用 2 。为了 进一步阐述姜黄素在受体水平的作用机理, 我们建立 了爪蟾卵母细胞人L D L受体 (L D L - R) 基因表达系统, 分析姜黄素对人类L D L受体基因表达的影响, 从受体 水平研究姜黄素降低血清胆固醇的作用机理。 材料与方法 1 材料成年雌性非洲爪蟾, 购自中国科学院上 海细胞研究所, 由本室饲养, 可供常年使用; 含人类 L D L - R基因质粒p 3 . 7L D L由E s t o n i a,T a r t u大学分 子和细胞生物学研究所惠赠。胶原酶、 胰蛋白酶和透
12、 明质酸酶购自S i g m a公司, D i I购自美国B i o t i u m公 234 中国中西医结合杂志2 0 0 5年5月第2 5卷第5期C J I TWM,M a y2 0 0 5,V o l . 2 5,N o . 5 司, 超级新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研 究所, 1 6 4 0培养基购自美国G I B C O B R L公司, 羊抗兔 I g G - H R P和羊抗兔I g G - F I T C购自华美生物工程公 司, 兔抗牛L D L - R多克隆抗体由本室制备。 2 爪蟾卵母细胞的培养冰块麻醉爪蟾, 下腹部 酒精消毒后作1c m左右切口, 取出卵母细胞块放
13、入培 养皿中, 用M o d i f i e dB a r t h sS o l u t i o n(M B S) 培养液 N a C l 5 1 . 4 3g,K C l 0 . 7 5g,N a H C O 31 . 9 9g , M g S O4 7 H2O2 . 0 2g,MO P S1 0 . 4 6g, 用重蒸水定容至5 0 0 m l, 标为A液; 称取C a (N O 3)2 4 H 2O0 . 7 8g , C a C l 2 7 H2O0 . 0 6g, 用重蒸水定容至5 0 0m l, 标为B液。用 时, A液、B液各稀释1 0倍后1 : 1混合,T r i s调节 p
14、H 至7 . 4, 每1 0 0 0m l加庆大霉素7 0m g 清洗5次, 加入 1m g m l胶原酶, 置2 0 人工气候箱微微震荡, 消化 过夜后倒去酶解液, 用无钙M B S培养液清洗3次以去 除细胞之间的粘连。再用M B S培养液清洗5次。此 后加入M B S培养液在2 0 人工气候箱中培养1h左 右, 挑选、期正常发育的爪蟾卵母细胞。每1 2h 更换1次M B S培养液, 连续培养3天。用孕酮处理诱 导卵母细胞成熟生发泡破裂 (g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k - d o w n,G V B D) 的实验判别细胞的质量 3 。 3 D i
15、 I - L D L的制备 健康人血浆经序列超速离 心后 获 得 密 度1 . 0 1 91 . 0 6 0部 分,进 一 步 用 S e p h a r o s e 6 B凝胶柱过滤, 获得纯化的L D L, 取2m g L D L与2 5m g不溶性马铃薯淀粉置于试管中涡旋震 荡, 然后迅速用液氮冷冻、 真空干燥器冷冻干燥。冻干 粉储存于4 , 用时加入5m l - 2 0 的正庚烷, - 2 0 孵育, 每1 0m i n涡旋震荡1次。1 . 5h后20 0 0rm i n 4 离心1 0m i n弃沉淀。重复上述操作1次, 上清液 中加入4 . 5 m gD i I,-2 0 孵育2h
16、后取出加入 - 2 0 的正庚烷0 . 4m l, 在冰浴中用高纯氮气吹干。 加入1 0m m o lL的T r i c i n e和0 . 0 1 %的叠氮钠1m l, 4 冰箱中孵育4 1h, 每隔一定时间取出混匀1次。 4 0 0 02r m i n离心1 5m i n, 取上清1 20 0 0rm i n离心 2 0m i n, 重复1次, 所得的上清含D i I - L D L, 于4 保 存 4 。以L o w r y法测定上清液中的蛋白质浓度。 4 人L D L - R基因在爪蟾卵母细胞中的表达取 、期卵母细胞1 0 0个分为2组, 在显微镜下进行卵 母细胞核注射, 实验组每卵注
17、入2 0n g 2 0 n lp 3 . 7 L D L。对照组每卵注入2 0n l无菌水。两组细胞放入 2 0 人工气候箱培养, 每1 2h更换1次M B S培养液。 2天后取卵细胞以1m g m l的透明质酸酶2 0 消化 1 0m i n, 用M B S清洗3遍。设计以下3组实验: (1) 取 实验组和对照组各2 0个卵置2 4孔板, 每孔加0 . 2 m l 含0 . 5 %牛血清白蛋白的M B S培养液作用1h, M B S 清洗3遍。每孔加1 : 5 0 0稀释的兔抗牛L D L - R抗血 清0 . 2m l, 3 7 孵育1h,M B S洗3遍, 用4 %甲醛溶液 固定1 0m
18、 i n, M B S洗3遍, 每孔加1 : 1 0 0 0稀释的羊抗 兔I g G - F I T C0 . 2m l, 3 7 孵育1 . 5h。用M B S洗3遍 后, 卵母细胞压碎涂片, 在荧光显微镜下观察。 (2) 取 实验组和对照组各2 0个卵, 在1m l含2 0 g m lD i I - L D L的M B S培养液中2 0 人工气候箱孵育5h,4 % 甲醛固定1 0m i n, 用M B S洗3遍后将卵母细胞压碎涂 片, 在荧光显微镜下观察。 (3) 取实验组和对照组各 1 0个卵置2 4孔板, 每孔加0 . 2m l含0 . 5 %牛血清白 蛋白的M B S培养液作用1h,
19、 M B S清洗3遍, 每孔加 1 : 5 0 0稀释的兔抗牛L D L - R抗血清0 . 2m l,2 0 孵育 2h,M B S洗3遍, 每孔加1 : 10 0 0稀释的胶体金标记 羊抗兔I g G, 2 0 孵育2h,M B S洗3遍后用5 %戊二 醛固定液固定, 用透射电镜检测。 5 姜黄素对爪蟾卵母细胞存活率的影响设立 0 . 3、0 . 6、0 . 9、1 . 2和1 . 5g m l 5种姜黄素浓度, 每个 浓度培养5 0个、 期卵母细胞,2 0 人工气候箱以 含药M B S培养液培养3天, 每1 2h更换1次含药 M B S培养液。3天后计算细胞的存活率。 6 姜黄素对人L
20、D L - R基因表达的影响取6 0 0 个、 期爪蟾卵母细胞, 每个卵母细胞核注射2 0n g 2 0n l的p 3 . 7L D L, 将其分为3个用药组和1个阴性 对照组。3个用药组分别用0 . 3、 0 . 6、0 . 9g m l的姜 黄素M B S培养液培养, 阴性对照组以M B S培养液培 养; 2 0 人工气候箱培养2天, 每1 2h更换1次培养 液。阴性对照组, 取1 5 0个细胞, 每卵注射2 0n l无菌 水, 以M B S培养液培养, 其余培养条件同前。2天后 各组卵母细胞平均分为5个复孔样本置2 4孔板, 以 1m g m l的透明质酸酶2 0 人工气候箱消化1 0m
21、 i n, M B S清洗3遍。含0 . 5 %牛血清白蛋白的M B S培养 液封闭1h,M B S清洗3遍。然后每孔加1 : 5 0 0兔抗 牛L D L - R抗血清0 . 2m l, 2 0 孵育1 . 5h。以M B S洗 3遍, 用4 %甲醛溶液固定1 0m i n。以M B S洗3遍。 每孔加羊抗兔I g G - B i o(1 : 5 0 0) 0 . 2m l, 以M B S洗3 遍, 各孔加1 : 5 0 0亲和素- H R P0 . 2m l, 2 0 孵育1 . 5 h。以M B S洗3遍, 每孔加显色液0 . 1m l, 暗箱显色 3 0m i n后每孔加2 0 %的硫
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