基因芯片技术筛选干扰素β刺激HEPG2细胞后的差异表达基因.pdf
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1、中国新药与临床杂志( C h i n J N e w D mps C l ia R e m ) , 2 0 0 6年1 月, 第2 5卷第 1 期 文章编号 1 0 0 7 - 7 6 6 9 - ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 1 7 - 0 4 基因芯片技术筛选干扰素p 刺激H e p G 2 细胞后的差异表达基因 钟彦伟 ,2 , 成军3 - , 曲建慧 2 , 李晓东 2郭江3 , 戴久增 2 ( I . 中国人民解放军军医进修学院, 北京1 0 0 8 5 3 ; 2 . 中国人民解放军第 3 0 2医院传染病研究 所 病毒性肝炎研究室, 北京1 0 0 0 3 9 ;
2、3 . 北京地坛医院 传染病研究所, 北京1 0 0 0 1 1 ) 关键词 干扰素R ; 重组蛋白质类; 基因表达; A t p芯片 t 摘要 目 的: 应用基因 芯片 技术阐明重组千扰素p ( I F N - p ) 作用H e p G 2细胞后, 对H e p G 2 细胞基因 表达 谱的影响。方法: 以2 x 1 0 0 U . L - , 浓度的重组I F N - R 刺激对数生长期的H e p G 2 细胞系, 以 生理盐水处理的 H e p G 2 细 胞为平行对照,制 备转染 后的 细胞裂解液, 提取m R N A 。应用基因表达谱芯片技术对差异 表达的 m R N A进行检测
3、和分析 结果: H e p G 2 细胞经重组I F N - (3 刺激之后, 有8 0 条差异基因表达, 其中3 8 条基因表 达增强, 4 2条基因表达降低。 这些差异表达基因与细胞的增生, 分化和细胞的信号转导密切相关。 结论: 应用 基因 表达谱芯片技术筛选到重组I F N - p作用I l e p G 2 细胞后 差异表达基因, 为进一步了 解I F N - p 治疗病毒性 肝炎 的作用机制提供新的依据。 【 中图分类号 R 9 7 8 .7 文献标识码 A S c r e e n i n g o f g e n e s d i f f e r e n t i a l l y e x
4、 p r e s s e d i n H e p G 2 c e l l s b y i n t e r f e r o n - b e t a w i t h m i c r o a r r a y a s s a y Z H O N G Y a n - w e i t ,2 , C H E N G J u n , Q U J i a n - h u i z , L I X i a o - d o n g 2 , G U O J i a n g 3 , D A I J i u - z e n g 2 ( 1 . M i l i t a r y P o s tg r a d u a t e M
5、 e d i c a l C o l l e g e o f P L A, B E I J I N G 1 0 0 8 5 3 , C h i n a; 2 . V i r a l H e p a t i t i s R e s e a r c h C e n t e r , I n s ti t u t e of I n f e c t i o u s D i s e a s e s , t h e 3 0 2 n d H o s p i t a l o f P L A, B E I J I N G 1 0 0 0 3 9 , C h i n a; 3 . I n s t i t u t e
6、 of I n f e c t i o n s D i s e a s e s , B e ij i n g D it a n H o s p it a l , B E I J I N G 1 0 0 0 1 1 , C h i n a ) K E Y WOR D S 了 i n t e r f e r o n - b e ta ; r e c o m b i n a n t p r o t e i n s ; g e n e e x p r e s s io n ; g e n e c h i p A B S T R A C T A I M : T o i n v e s t i g a t
7、 e t h e b io lo g i c a l f u n c t i o n s o f r e c o m b i n a n t i n t e r f e r o n - b e t a ( I F N - P ) , a n d t o u s e c D N A m i c r o a r r a y t e c h n i q u e t o s c r e e n d i f f e r e n c e g e n e e x p r e s s i o n p r o fi l e i n H e p G 2 c e l l s b y r e c o m b i n
8、a n t I F N - p M E T H O D S : T h e r e c o m b i n a n t I F N - pw a s u s e d t o s t i m u l a t e H e p G 2 c e l l s i n v i t r o . A f t e r 1 6 h , t h e t o t a l R N A w a s i s o l a t e d a n d r e v e r s e l y t r a n s c r i b e d . T h e c D N A s w e r e s u b j e c t e d f o r m
9、 i c r o a r m y s c r e e n i n g w i th 1 1 5 2 c D N A p r o b e s . R E S U L T S : H i g h q u a l i t y m R N A a n d c D N A h a d b e e n p r e p a r e d a n d s u c c e s s f u l m ic r o a r r a y s c r e e n i n g h a d b e e n c o n d u c t e d , r e s u l t i n g w i t h f o u n d 3 8 g
10、 e n e s w e r e u p - r e g u l a t e d a n d 4 2 g e n e s w e r e d o w n - r e g u l a t e d i n H e p G 2 c e l l s i n d u e d w i t h r e c o m b i n a n t I F N - p .T h e s e d i f f e r e n c e s o f g e n e e x p r e s s i o n s i n v o l v e d i n i m m u n e r e g u l a t io n c e l l ,
11、 s ig n a l t r a n s d u c t i o n , e t a l . C O N C L U S I O N : U ti l i z i n g c D N A m i c r o a r my t e c h n i q u e s c r e e n in g c a n o b t a i n r e c o m b i - 收稿日期1 2 0 0 5 - 0 7 - 2 8接受日期2 0 0 5 - 1 2 - 0 2 作者简介钟彦伟 1 9 6 5 - ) , 女, 吉林通化人, 副研究员, 博士研究生, 主要从事病毒性肝炎发病机制及抗病毒治疗研究。 1
12、联T 人1成 军。P h n : 8 6 - 1 0 - 6 4 4 8 - 1 6 3 9 ,. F a x : 8 6 - 1 0 - 6 4 2 8 - 1 5 4 0 0 E -m a i l : c j g e nt h e r a p y .c o m .e n 通讯 作 者 中国新药与临床杂志( C h in J N e w D mg s C l in R e m) , 2 0 0 6年1 月, 第2 5卷第 1 期 n a n t I F N - pa s a t r a n s - r e g u l a t o r fo r m a n y g e n e s e x p
13、r e s s io n s o f im p o rt a n t b i o l o g i c a l i m p l i c a t i o n s , a n d f u rt h e r m o r e c o u l d p r o v i d e n e w i n f o r m a ti o n f o r i n v e s t i g a t i n g t h e i m m u n e r e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f I F N - 日o n v i r a l h e p a t it i s . 慢性乙型病毒性
14、肝炎严重危害我国人民健康。 到目 前为止还没有有效而可靠的治疗办法。虽然干 扰素 a ( I F N - a ) 有一定的抗病毒作用, 但研究表明仅 对3 0 % - 4 0 % 的病人有持续抗病毒学应 答。 拉米夫 定虽然有一定效果,但长期使用易引起耐药变异。 近年来有研究证明, 干扰素 p ( I F N - 团可有效治疗 I F N - a治疗无效的慢性乙肝病人0 1 , 不易产生抗体, 有望达到抗 H B V复制和抗纤维化的双重目的。也 有研究者推荐对H B e A g 阴性和 ( 或) H B V D N A阳 性的慢性乙型肝炎病人用I F N - p 治 疗Q 1 。 但是I F
15、N - p 抗病毒作用的分子生物学机制目前还不十分清楚。 我们利用基因表达谱芯片技术筛选重组 I F N - p作 用于 H e p G 2 后的差异表达基因,探索重组 I F N - p 表达对于肝细胞基因表达谱的影响。 材料 和方法 实 验材料和 试剂 H e p G 2 细胞由本室保 存。 细 胞培 养相关试剂及总 R N A提取试剂T r iz o l 均购 自G i b i - 。公司。重组 I F N - 日由瑞士雪兰诺公司生产。表达 谱芯片由上海联合基因有限公司提供。 细胞培养和取材在 3 5 m m细胞培养皿中培养 H e p G 2 细胞,细胞生长至对数生长 期时, 加人2
16、x 1 0 6 L - L - , 重组 I F N - p作用 1 6h后收获细胞, 对照组 加相同体积的生理盐水。每 5x1 护个细胞加人 1 m L T r i z o l 试剂, 立即于液氮中 保存。 总 R N A提取及 r n R N A纯化使用T r i z o l 试剂一步 法提取 I F N - ( 3 及生理盐水处理的 H e p G 2细胞总 R N A( 分别标记为实验组和对照组) , 样品经分光光 度计检测吸光度A值,并进行热稳定实验,于一 加 和 7 0保温 1 h后,经琼脂糖凝胶电泳检测 2 8 S , 1 8 S条带变化。以 Q i a g e n公司O l i
17、 d o t e x m R N A M i n i K i t 纯化m R N A 。操作按说明书 进行。 探针标记按常规方法逆转录标记 c D N A探针并 纯化。C y 3 - d U T P 标记对照 组细胞m R N A ( 5 W g ) , C y 5 - d U T P 标记实验组细胞m R N A ( 5 W g ) 。乙醇沉 淀后溶解在2 0w L5xS S C+0 .2%S D S杂交液中。 芯片制备芯片包含的 1 1 5 2个c D N A由上海联合 基因有限公司提供,包括原癌基因和抑癌基因, 免 疫调节相关基因、 细胞凋亡和应激反应蛋白相关基 因, 信号转导相关基因等
18、。以通用引物进行 P C R扩 增。 P C R产物长度为1 0 0 0 - 3 0 0 0 b y 。靶基因以。 0 .5 g “ L - 溶解于3 x S S C溶液中,用 C a rt e s i a n 公司 的 C a rt e s i a n 7 5 0 0点样仪及T e l e e h e m公司的硅熔解 化玻 片进 行点样 。玻 片水合 ( 2 h ) , 室温干燥 ( 3 0 m i n ) , 紫外线( U V) 交联, 再分别用 0 . 2 % S D S , 水及0 . 2%的硼氢化钠溶液处理 1 0 m i n , 晾干备用。 杂交及洗涤将基因芯片和杂交探针在 9 5
19、水浴 变性5 m i n , 将混合探针加在基因芯片上, 置于6 0 C 杂交 1 5 - 1 7 h 。 依次以 2 x S S C + 0 . 2 % S D S , O . l x S S C+0 .2%S D S , 0 . 1 x S S C洗涤 1 0 m i n , 室温晾+。 检IN与分析 用G e n e r a l S c a n n i n g 公司 的S c a n A r r a y 3 0 0 0扫描芯片。 用预先选定的内参照基因( 2 4条 管家基因, 每个基因点2 个点, 共4 8 个点) 对C y 3 和 C y 5 的原始提取信号进行均衡和修正。 用I m
20、a G e n e 3 .0 软件分析C y 3 , C y 5 两种荧光信号的强度, 计算 C y 5 / C y 3比值 。 阳性 结 果判 断 : C y 5 / C y 3 2 .0 , 红色荧光, 显示表达增强; C y 5 / C y 3 0 .5 , 为绿 色荧光 , 显示表达减弱。 结果 总 R N A及mR N A的定性、 定量分析实验组和对 照 组 总 R N A 的吸 光 度 比值 A / A m 分 别 为 1 .9 8 0和2 .0 0 0 , 热稳定实验 7 0保温 I h与一 2 0 Ih电泳条带比较, 显示 2 8 S条带无明显降解, 电泳 结果证实已抽提高纯度
21、的总R N A o m R N A主要集中 于。 . 9 - 4 .0 k b p 的连续 条带。 芯片杂交体系验证及结果分析在芯片上共有 1 1 5 2 个。 D N A 。为了监控芯片杂交体系的 整个过 程, 在芯片上设置了阴性对照( 8条水稻基因, 共 8 个点) , 这些点的杂交信号均很低, 证实 了 数据的可 靠性。由于实验组探针标记 C y 5荧光素( 呈红色) , 对照组探针标记C y 3 荧光素( 呈绿色) , 红绿颜色的 差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达 水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异。按阳性 标准, 从 1 1 5 2 个基因中筛选出差异表达基因共8 0
22、条, 占7 .0%, 其中3 8 条基因表达增强( 表 1 ) , 4 2条 基因表达降低( 表2 ) 0 中国新药与临床杂志( C h i n J N e w D r u g s C li n R e m) , 2 0 0 6 年 1 月, 第2 5 卷第1期 表J 干扰素 R 刺激表达增强的基因 编号C y 5 / C y 3 比值 基 因 名 称 表2 干扰素 p 刺激衷达降低的墓因 编号 C y 5 / C y 3 比值基因名称 0 . 2 8 6 0. 295 0 . 2 9 8 0 . 3 1 4 0 . 3 2 4 0 . 3 3 5 0. 3 6 4 0. 36 9 0 . 3
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