定位于12Q24的腓骨肌萎缩症2L型10个候选基因的排除克隆.pdf
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1、 临床遗传学研究 定位于 12q24 的腓骨肌萎缩症 2L 型 10 个候选 基因的排除克隆 张如旭唐北沙资晓宏罗巍夏昆潘乾胡政茂赵国华郭科 【摘要】 目的克隆定位于 12 号染色体微卫星标记 D12S1720 和 D12S1611 之间约 6.8 cM 的区间内的 腓骨肌萎缩症 2L 型的致病基因。方法应用生物信息学方法筛选 10 个候选基因, 设计合成扩增 10 个基 因外显子及外显子与内含子交界的引物, DNA 直接测序法进行序列变异分析。结果在基因外显子及侧 翼区共发现 11 个序列变异, 其中杂合序列变异共 5 个, 纯合序列变异共 6 个。上述序列变异与疾病表型无 共分离现象。结论
2、排除了 10 个候选基因 (TAOK3、 RAB35、 RPLP0、 PXN、 RNF10、 RHOF、 VPS33A、 RSN、 DENR、 RNP24)为腓骨肌萎缩症 2L 型致病基因的可能。发现了以上 10 个候选基因共 11 个单核苷酸多态, 除镜影 细胞 (reed-steinberg cell, RS) 细胞特异性中间丝相关蛋白基因的 3207GC 在多态数据库已报道, 其余均为 新发现的单核苷酸多态。 【关键词】 腓骨肌萎缩症 2L 型; 候选基因; 基因克隆; 单核苷酸多态性 Cloning to rule out 10 candidate genes located in c
3、hromosome 12q24 for Charcot-Marie-Tooth disease type 2L* ZHANG Ru-xu1, 2,TANG Bei-sha1,ZI Xiao-hong2,LUO Wei3,XIA Kun4,PAN Qian4,HU Zheng-mao4, ZHAO Guo- hua1,GUO Ke2. 1( Department of Neurology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan, 410008 P . R . China) ; 2 (Department of Neurol
4、ogy,the Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha, Hunan,410013 P . R . China) ; 3 (Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital,Medical College of Zhe- jiang University,Hangzhou,Zhejiang,310003 P . R . China) ; 4 (National Key Laboratory of Medical Genetics,Cen- tral South
5、University,Changsha,Hunan,410078 P . R . China) Corresponding author:TANG Bei-sha,Email:bstang7398yahoo . com . cn 【Abstract】ObjectiveTo clone the disease-causing genes possibly existing in 6.8 cM distance between mi- crosatellite markers D12S1720 and D12S1611 in chromosome 12q24 for Charcot-Marie-T
6、ooth disease type 2L (CMT2L) . MethodsTen positional and functional candidate genes were chosen among all known genes in this locus region by bioinformatics inqury. Mutation detection was performed by sequencing the exons and intron-exon junctions of the candi- date genes. ResultsEleven sequence var
7、iations,that included 5 heterozygous and 6 homozygous variations,were de- tected in the exons and flanking areas of the 10 candidate genes. All the variations showed no co-segregation with disease phenotype. ConclusionTen candidate genes(TAOK3, RAB35, RPLP0, PXN, RNF10, RHOF, VPS33A, RSN, DENR, RNP2
8、4)were ruled out as the disease-causing gene for CMT2L.Ten single nucleotide polymorphisms (SNP)were reported for the first time. 【Key words】 Charcot-Marie-Tooth disease type 2L; candidate genes; gene cloning; single nucleotide poly- morphism *Supported by the National Nature Science Foudation of Ch
9、ina(Proj. No. 30300200) ,and the National 863 Project of China (2004AA227040) 腓骨肌萎缩症 (Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 是一类具 有明显临床和遗传异质性的周围神经病单基因遗传病, 发病率 约为 1/2500, 其遗传方式主要为常染色体显性遗传, 其次为常 染色体隐性遗传及 X 连锁显性或隐性遗传。临床主要表现为 进行性对称性远端肌无力和肌肉萎缩、 腱反射减弱或消失、 轻 到中度远端感觉减退。临床上依据病理和电生理特点可分为 两型: CMT1 型 (脱髓鞘型) 和 CMT2 型
10、 (轴索型) 1, 2。自 1992 年 PMP22基 因 作 为 CMT1A的 致 病 基 因 被 克 隆 以 来 , 共 有30个 基金 项 目: 国 家 自 然 科 学 基 金 (30300200) ; 国 家 863 计 划 项 目 (2004AA227040) 作者单位: 410008 长沙, 中南大学湘雅医院神经内科 (张如旭、 唐北 沙、 赵国华) , 湘雅三医院神经内科 (张如旭、 资晓宏、 郭科) , 中国医学遗 传学国家重点实验室 (夏昆、 潘乾、 胡政茂) ; 浙江医科大学附属二医院 神经内科 (罗巍) 通信作者: 唐北沙, Email:bstang7398 不同的 C
11、MT 遗传位点被定位, 19 个致病基因相继被克隆 3。 Tang 等 4应用全基因组扫描技术及单倍型分析的方法, 将 1 个 常染色体显性遗传的 CMT2 型大家系致病基因定位于 12 号染 色体微卫星标记 D12S1720 和 D12S1611 之间约 6.8 cM 的区间 内, 这是国际上定位的一型新的 CMT 疾病位点, 命名为 CMT2L 并被美国国立生物技术信息中心的人类在线孟德尔遗传网站 收录 (http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ Omim/ , OMIM 号 608673) 。 进一步克隆 CMT2L 的致病基因将有助于阐明遗传性周围神经 病
12、的发病机理, 从而为该疾病的预防及治疗奠定基础。 1对象与方法 1.1对象遗传了 7 代的常染色体显性遗传 CMT2L 大家系, 来自中国湖南和湖北两省, 其中可追问到的人数共 165 人, 35 人已死亡。选择家系中 26 名成员作为研究对象,设 100 名家 系外正常人为对照。 981中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet,April 2006,Vol. 23,No. 2 1.2方法 1.2.1候选基因的选择在 UCSC 数据库查询 D12S1720 D12S1611 之间的基因信息, 这个区间总计有已知基因 126 个, Refer
13、ence Genes 88 个。综合分析候选基因的组织表达、 周围神 经结构和生理基础并结合已克隆的周围神经遗传病的致病基 因编码蛋白的结构功能, 筛选了 10 个候选基因进行序列变异 分析, 分别为: TAO 激酶 3(TAOK3/ JIK)基因、 原癌基因家族 RAS 成 员RAB35基 因(RAB35 )、核 糖 体 蛋 白 P0 基 因 (RPLP0)、 桩蛋白基因(PXN)、 环指蛋白 10 基因(RNF10)、 RAS 原癌基 因 家 族成员 F 基因(RHOF)、 空泡蛋白 转 运 33 基 因 (VPS33A)、 RS 细胞特异性中间丝相关蛋白基因(RSN)、 密度调 节蛋白基
14、因 (DENR) 、 包被囊泡膜蛋白前体 24 基因(RNP24)。 1.2. 2PCR使用 primer3 在线软件 (Http: / / www-genome. wi. mit.edu/ cgi-bin/ primer/ primer3.cgi/ ) 设计引物, 由上海博亚生物 技术有限公司合成。引物参数设定:GC 含量设定在 40% 60%; 退火温度设定在 57 63之间。扩增片段一般设定在 200 bp 500 bp 之间。以完整扩增在周围神经表达的剪接本和 最大剪接本为目标, 合成了扩增 10 个基因外显子及外显子与 内含 子 交 界 的 引物共 111 对。PCR 反应体系为 1
15、0L, 其 中 dNTPs 20mol/ L, 引物各 0.25mol/ L, MgCl21.5 2.0 mmol/ L, gDNA 为 50 ng, Hot Star Taq DNA 聚合酶 0.25 U, 10 缓冲液 1 L, Q-缓冲液 2L。扩增条件: 95 15 min 热起动; 94 30 s, 60 30 s, 72 1 min, 10 个循环; 94 30 s, 56 30 s, 72 1 min, 25 个循环; 72 10 min; 4保存。选取先证者进行 PCR 扩 增。 1.2.3测序和序列分析酶切后的 PCR 产物经 ABI PRISM 377 自动测序仪正反向测序
16、, 测序结果用 DNASTAR 软件中的 Edit- Seq、 SeqMan 程序分析。 1.2.4序列变异的判断发现的杂合序列变异先在 NCBI 和 TSC 的多态数据库 (dbSNP http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ SNP/ ; TSC http: / / snp.cshl.org/ ) 进行查询排除已知单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP) , 再进行家系内患者、 家系 内正常人及家系外正常对照的检测观察序列变异与疾病表型 有无共分离现象。 2结果 2.110 个候选基因的生物学信息通过生物信息学查
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