影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展.pdf
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1、1 3 8 2 现代生物医学进展, 八 叨 盯 .班o me d. n et. or 赞 。 少e 88饭Mo d e 扭B iom e 由c 纽e 2 0 0 8 T rO 】 , 8NO . 7 影响外源蛋白 在巴 斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展 张垂斌 傅正伟 ( 浙江工业大学生物与环境工程学院 浙江杭州31003 2) 摘要: 巴 斯德毕赤酵母( 巧 ch认 p as t o ri s) 表达系 统是墓因 工程研究中 广泛使用的外源蛋白 表达系 统。 但外源基因 在该系 统中 表达 时, 由于受自 身 特性及环境等诸多因 素的影响, 在表达过程中出 现表达童不够稳定或较低, 甚至不
2、表达的情况。本文对影响巴 斯 德毕赤酵 母表达的各种可能因 素进行了 分析, 并就知何提高外源 基因 在巴 斯德毕赤酵 母中 表达量的问 题进行了简 要的综述。 关键词: 巴 斯德毕赤酵 母; 酵 母表达系 统; 基因 表达 中图分类号: Q 7 8 文献标识码: 文章编号: 1 6 7 3 一 6 2 7 3 ( 2 0 0 8 ) 0 7 一 1 3 8 2 一 0 3 A dva n c e i n R e c o m b i n ant P ro t e i n s S e c r e t i o n b y P i c h i a P a s t o r i s E xPr e s
3、s i o n s y s t e m 2 月 片 入 吞cb即 暨 脑 厂 U 乃口 移 能尸 ( 。加 罗浏 习 初 鲍俪1 翻 d En动 回肠 呀 勿 e 朗 叹 9 勘可 自 明的1 哪 1 守 oI介 司 功 。 彻 飘价昭 劝 姚3 1 0 刃 2, 乃动 助 肠 。 血 口 少 A B S 们 刃 扰 牙 : The P i c h i a P aS t 0 ri s e x P r e s s i o n s y s t e mi s b e in g u se d su c c e s s fu l lyfo r th e P ro d u c t i on o f van
4、 ous re c omb in ant h e t e r o 1 0 - g o uSP ro te ins. B utth e fo re i gng e n e e x P r e s si onorthe P ro t e in如 el d isin fl u e n c e d bythe c h a ra c t e ri sti cso f th e ge n e and th e environ m e n ta l 阮加 招 . T 五 e sefa c t o .m ake so me h 比m fo gousg 心 n e s e x P re ssunstab lyo
5、reven e xPre ssa l itt 1 e . We ana l丫 阳he res o me o f these伽t o 岛a n d brie nyre vi e wh o wtohaP ro vee x P os i onl eve 1 s o f het e ro fo g ous gen e s inPi c h iaP as to ri s . K 即w 份 山: P i chi a P a s t o ri s ; Y e aste x P re s si ons y s t e m ; C 即e exPres s i on Q血e seL i b ra ryC la S
6、S 近 c atio n ( C L C ) : Q78 D OC 切 叮 周 吐 c 目已 : A A 币 c l e ID: 1 6 7 3 石 2 7 3 ( 2 008 ) 0 7 一 1 3 8 2 刁 3 前言 表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要工具, 随着后基因组时代的到来和重组蛋白药用领域的扩大, 发展经 济、 高效、 安全的外源蛋白 表达系 统一直是生命科学研究领域 的 热点。 酵母属于单细胞低等真核生物, 具有原核生物易于培 养、 繁殖快、 便于基因工程操作及高密度发酵等特性, 又不存在 原核表达系统的内毒素难以除去的问题, 也不存在哺乳动物细 胞表达系统的 病毒
7、和支 原体污染等问题, 并能够对目 的蛋白 进 行类似高等真核生物的翻译后蛋白 修饰、 加工. 还能分泌外源 蛋白 到培养液中, 利于纯化, 已 经越来越广泛地被应用于外源 蛋白的表达。 巴 斯德毕赤酵母( Pi c hi a p astoris ) 作为甲醇营养型酵母的 一种, 能够在以甲醇作为单一碳源的培养基上生长, 具有表达 量高、 稳定 性高、 分泌量高和自 身分泌蛋白 少、 糖基 化程度低等 的 优点在近十年中 受到广泛青睐, 特别是毕赤酵母分泌的 糖蛋 白 末端不含一 1 ,3 一 甘露糖残基, 避免了 像5 . ce re vi si 鸽一样的免 疫原性, 使表达的糖蛋白 更适于
8、医 疗用途。目 前已 有4 00多种 外源蛋白 在毕赤酵母表达系统中 得以 成功表达llq, 是目 前最成 功的外源蛋白表达系统之一。 尽管巴 斯德毕赤酵母在表达外源蛋白 上存在诸多优势, 但 外源基因 在表达过程中 受自 身特性和诱导条件的影响而不稳 定. 甚至一些蛋白的表达量会很低甚至不表达。 因 此, 通过对一 些可能影响 外源基因表达的因素进行系统的 分析, 寻找提高外 源蛋白表达的可能途径具有重要的理论和实践意义。 作者 简 介: 张 示 斌( 1 9 82 一 ) , 男, 硕士 在 读, 研 究方向: 分子 生物 学 通讯作者: 傅正伟( 1 9 63一 ) , 教授, E .
9、m 画 1 渭 刃 胃 I U Z oo3 y 曲00的m .沈 ( 收稿日 期: 2 007 一 1 1 一 1 6接受日 期: 2 0 0 7 1 2 一 2 1 ) 1 外源 蛋白自 身的 影响 外源基因的密码子主要在翻译水平上影响基因的表达。 尽 管各种生物使用的密码子都大同 小异, 但巴 斯德毕赤酵母也有 特殊的密码子偏好趋向。 特定的( A 干 T ) 富含区 可作为多腺昔酸 或转录终止信号, 导致仅产生低水平或截短的m 只 N A ; 某些稀 有密码子, 尤其是稀有密码子密集区往往成为制约翻译速率的 因素。 因 此在某些情况下可通过定点突变去除成熟前终止结构 域和替换稀有密码子,
10、 使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子 用法和更高的 ( C 十 C ) 含量。其次是5和3端非翻译区( Un- 仃 阴 sl ated re gi o n , U 皿 ) 对蛋白 表达产生的影响, 适当 长度的5 端U T R 可以 极大地促进m R N A的有效翻 译, 太长或太短都会 造成对核糖体405 亚单位识别的障碍。目 前的 研究认为, 目 的 基因5端U T R的长度应与醇氧化酶基因 ( Aco h o l oxi d as e l , A O X I)的m R N A夕端U T R 尽可能的相近或一致。 外源蛋白自 身的 理化特点也影响其表达和分泌。 由于蛋白 质在内 质网和高尔
11、基体中 被加工修饰后的去向由 蛋白质自 身 特点决定, 一般不分泌的蛋白 很难使其分泌。因此外源蛋白的 空间构象、 糖基化位点、 水溶特性、 氨基酸组成以及其它的理化 特点都影响 毕赤酵母对其分泌以 及蛋白 酶的 水解特点。 所以 应 根据外源蛋白自 身的理化特点来选择胞内 表达或分泌型表达 方式。 2启动 子的 选择 启动子在转录 水平上调控基因的表达, 是基因表达的关键 万方数据 现代生物医学进展, , 贾 .b i o 二 ed.n etcnF 份 0 少e 88恤M ode 二 B i o m e 山c ine Z oo8 V o 】 . S N o. 71 3 8 3 元件, 直接关
12、系到 表达水平。最常用的 启动子是醇氧化酶基因 ( A o xl),由 它控制的 外源基因 在甲 醇的 诱导下得到高效表 达, 表达量最高可达细 胞可溶性蛋白 总量的30% 。 但甲醇不适 用于食品工业生产, 还是一种火灾隐患, 这在一定程 度上限制 了A O XI 启动子的 使用。 S h e n 等13 报道从巴 斯德毕赤酵母中 克隆到甲 醛脱氢酶基因 (Fo n 力 a ld e h y dede h y diDge nase l , F L D 1)的诱导型启动子, 具有与A O XI 启动子相同甚至更高的强 度, 能在以甲 醇作为唯一碳源或以甲 胺为唯一氮源( 葡萄糖、 甘 油为碳源
13、) 的情况下表达。 除了诱导型启动子外, 3 一 磷酸甘油醛 脱氢酶基因 ( C y c e rald e h yd e 一 3 , b o sP h atede h y dr o g e n as e , G AP) 的启动子具有很强的组成型表达能力, 使用G A 卫启动子在发 酵时不需要甲 醇诱导, 不必更换碳源, 工艺简单, 但该启动子不 适合表达毒性蛋白。 根据实际清 况选用不同类型的启动子, 扩大了毕赤酵母的 应用范围, 解决了甲醇毒性限制发酵产物商业化的问题, 在食 品医药方面将有很好的应用前景。 但是, 当外源蛋白 在工程菌中 大量表达时, 由于工程菌内 环境的变化和( 或) 分
14、泌表达系统的超载, 而造成部分外源蛋白 在菌体内的大量错误折叠、 积累和降解, 从而导致表达量的降 低。 尤其是在多 拷贝 基因工程菌中 经常有随着拷贝 数增加, 而 表达量反而减少的现象叽 H u b e 功 us和B ri g 加均 的 研究表明, 外源蛋白 的 过 量表达, 会导致细胞内尤其是内 质网腔内 分子伴侣浓度的 相对减低, 而 分子伴侣对外源蛋白的表达和活性结构域的 形成都起着至关 重要的 作用。 因 此胞内蛋白的聚合同 分子伴侣与 蛋白 数量间的 平衡关系成为提高外源蛋白 表达的一个瓶颈。 利用基因工程手 段提高细胞质和内质网中的 分子伴侣的浓度, 使酵母表达的外 源蛋白 能
15、在细胞质和内质网中形成正确的构象, 有可能成为打 破上述瓶颈. 已经成为目 前研究的热点( 见图 1 ) 。 3信号肤的选择 研究证实, 巴斯德毕赤酵母表达系统能以胞内和分泌方式 表达外源基因编码的蛋白。 分泌表达既可以减轻宿主细胞代谢 负荷, 又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解, 是一种理 想的蛋白 质生产方式。 表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号 序列的引导, 信号肤与目 标蛋白 相融合, 从而在蛋白质加工折 叠后引导其分泌到胞外。 可供选择的毕赤酵母信号肤分为两 类: 即 外源蛋白自 身的 信号肤和来源于酵母的信号肤。实验证实, 有些蛋白如人血清 白 蛋白、 转化酶、 小牛溶菌酶等,
16、 本身就属于分泌型蛋白, 用自 身的信号肚序列即可在巴斯德毕赤酵母中成功分泌表达。 目 前 所使用的酵 母源信号肤包括酿酒酵母一 性成熟因 子( . m a te伽- tor,。 绷 ) 前原信号肤序列、 蔗糖酶基因sUC Z 信号肚序列、 酸 性磷酸酶基因P H O I 的信号肤序列和间质金属蛋白酶( M M P ) / 间质金属蛋白酶组织抑制信号肚序列等。 其中, . N J前原信号 肤使用最广。 不同的 信号肤分泌效率不同, 所以 对于特定的蛋白, 需要 经过反复的 实验来确定最适合其分泌表达的 信号肤, 同时 对信 号肤进行突变改造或使用人工合成信号肤等策略可用于实现 对目的蛋白的正确
17、加工和提高分泌水平。 4转录后翻译水平 在毕赤酵母中表达的外源蛋白一般要经过几个程序的加 工才能形成有生物活性的目 的蛋白。 蛋白 质的分泌从细胞质中 的游离核 糖体上开始的。 一般的分泌蛋白 质在其N端具有信 号肤序列, 当信号肤序列合成后, 被信号识别颗粒( S RP) 所识 别, 蛋白 质合成暂停或减缓, 信号识别颗粒将核糖体携带至内 质网 上, 新合成的蛋白 质进人内 质网腔, 在内 质网中 被加工、 修 饰, 并被运输到高尔基体中进行进一步的修饰, 这个过程包括 信号肤的 加工、 二硫键的 重建、 蛋白 构象的正确折叠, 以 及适度 的糖基化、 磷酸化等等, 使所表达的外源蛋白 结构
18、与构象更接 近于天然蛋白。最后通过小泡运输到细胞膜, 通过与质膜融合 将其所包含的蛋白 质分泌到细胞外, 这就是经典的内 质网一高 尔基体( E R 心of gi) 蛋白 质分泌途径。 圈1分子伴侣在蛋白质分泌途径中的作用圈 F 咭 . I Role s ofmOl eC u l 越比 越 ” r o nes 山 叮 in g the n 沈 幻 m b l 山 川 t Pr o te l nS di o n 通过共表达外源蛋白和分子伴侣二硫键异构酶( 巧。 te in di su lfi dei some rase , PDI) 或重链结合蛋白( 远 叻 叨 。 g lo b u l in,
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