心力衰竭家兔左室短暂外向钾电流下调的分子基础.pdf
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1、心力衰竭家兔左室短暂外向钾电流下调的分子基础 闫继锋 刘志华 程绪杰 李红霞 宋建平 蒋庭波 杨向军 蒋文平 摘要 目的 为探讨心力衰竭 (简称心衰) 兔左室短暂外向钾电流 (Ito) 下调的分子基础。方法 采用结扎家兔 冠状动脉左前降支的方法制备缺血性心衰模型。应用膜片钳全细胞记录方法记录左室心肌细胞 Ito, 描记电流-电 压 (I-V) 曲线; 应用半定量-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 法检测电压依赖性 Kv1. 4 和 Kv4. 3 钾通道 亚单位 mRNA 表达, 并以图象分析系统对其进行半定量分析。结果 心衰组家兔左室心肌细胞 Ito密度较对照组显著降低, I-V 曲 线明显下
2、移; 指令电压为 + 70 mV 时, 心衰组 Ito密度 (9. 73 0. 94 pA/ pF, n = 5) 显著低于对照组( 14. 35 1. 16 pA/ pF, n =4)(P 0. 01) 。Kv1. 4 和 Kv4. 3 钾通道 亚单位 mRNA 表达心衰组 (分别为 0. 66 0. 05 , 0. 21 0. 02, n =5) 也较对照组 (分别为 0. 95 0. 07, 0. 531 0. 04, n =5) 显著降低 (P 均 0. 01) 。结论 心衰家兔左室 Ito电流 密度下调可能受转录水平调节。 关键词 心血管病学; 心力衰竭; 短暂外向钾电流; 膜片钳;
3、 基因表达 中图分类号 R541. 6 +1 R331. 3+8 文献标识码 A 文章编号 1007 -2659 (2006) 02 -0164 -04 作者单位: 苏州大学第一附属医院心血管内科 (江苏苏州 215006) 作者简介: 闫继锋 (1966 - ) , 男 (汉族) , 河南人, 博士研究生, 副主任 医师, 从事心脏电生理与心力衰竭研究。 Molecular basis of transient outward potassium current downregulation in rabbits with heart failure . YAN Ji-feng , LIU
4、Zhi-hua, CHENG Xu-jie, LI Hong-xia, SONG Jian-ping, JIANG Ting-bo, YANG Xiang-jun, JIANG Wen-ping. Depart- ment of Cardiology , The First Hospital Affiliated to Suzhou University,Suzhou 215006, Jiangsu, China Abstract Objective To investigate the molecular basis of transient outward potassium curren
5、t (Ito)downregulation in rabbits with heart failure (HF) . Methods Rabbits models of HF were established by ligation of the left anterior descend- ing coronary artery. Whole-cell electrophysiological recording was used to study changes of the Itocurrent density in isolated left ventricular myocytes
6、in rabbits, the curve of I-V relationship of Itowas depicted. Semi-quantitative RT-PCR was used to examine the mRNA level of Kv1. 4 and Kv4. 3 potassium channel subunit in ventricular tissues. Results Itocurrent density of myocytes were significantly decreased in rabbits with HF than those of contro
7、l group. The curve of I-V of Itoin HF group was decreased . Itocurrent density(at +70 mV)in HF group(9. 73 0. 94 pA/ pF)was markedly lower than that of control group (14. 35 1. 16 pA/ pF) . The mRNA level of Kv1. 4 and Kv4. 3 potassium channel subunit significantly decreased in failing heart(0. 66 0
8、. 05, 0. 21 0. 02)compared with nonfailing hearts (0. 95 0. 07, 0. 53 0. 04) . Con- clusions The downregulation of Itocurrent density in heart failure may be transcriptionally regulated. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology, 2006, 20 (2) : 164 167 Key words Cardiology; Heart failu
9、re;Transient outward potassium current;Patch clamp;Gene expression 心力衰竭 (简称心衰) 是引起死亡的主要原因 之一, 死于心衰者约 50% 表现为猝死, 其原因与发 生致命性室性心律失常有关。然而对心律失常的机 制还了解不多。有研究表明复极异常增加心衰发生 猝死的危险性, 肥大和衰竭心肌动作电位时程 (APD) 延长, 复极离散度增大, 心电不稳定性增 加 1, 2。钾电流特别是短暂外向钾电流 (I to) 的下调 引起复极异常, 其增加衰竭心肌的电不稳定性 1。 但 Ito功能性下调的分子基础还不清楚。最近研究 表明家兔具
10、有与其它哺乳动物不同的 Ito电流生理 特性, 呈现缓慢恢复动力学, 符合 Kv1. 4 通道的特 征, 家兔 Ito电流至少部分为 Kv1. 4 基因所编码 3。 为此, 笔者应用膜片钳技术记录 Ito, 半定量-聚合酶 链式反应 (RT-PCR) 检测 Kv1. 4 和 Kv4. 3 mRNA 表 达, 探讨家兔衰竭心肌 Ito下调的分子基础。 1 资料与方法 1. 1 家兔心衰模型的建立 26 只新西兰大白兔 (苏州大学 实验动物中心提供) , 体重1. 5 2. 5 kg, 分为对照组 (包括假 手术和正常家兔) 9 只和心衰组 17 只。3% 戊巴比妥钠 (30 mg/ kg) 耳缘
11、静脉麻醉, 不用气管插管和呼吸机, 仰卧位固定 于手术台, 沿胸骨左缘切口, 切断左侧第 2 4 肋软骨, 暴露 纵隔及心脏, 纵行切开心包, 用棉签轻轻压迫心脏使其搏动 幅度减弱, 心衰组结扎冠状动脉前降支中上 1/3 交界处, 观 461 中国心脏起搏与心电生理杂志 2006 年第 20 卷第 2 期 察 30 min, 心电图证实急性心肌梗死建立。假手术组仅冠状 动脉下穿线不结扎冠状动脉。模型制作后, 关胸, 缝合皮肤; 抗炎, 动物回笼饲养。 1. 2 心功能评价 1. 2. 1 超声心动图 术后约 8 10 周, 兔在清醒状态下用 超声心动图 (HP/ SONOS 5500, 7.
12、5 MHz 探头) 检查。静卧 5 min 后开始测量。在二维切面上显示胸骨旁左室长轴二尖 瓣水平观察, 然后采用 M 型超声心动图方法记录左室收缩 和舒张期运动曲线, 然后分别测量左室收缩末期内径 (LVSD) 、 舒张末期内径 (LVDD) 、 左房直径 (LA) 及射血分数 (EF) 。 1. 2. 2 有创血流动力学指标测定 测定超声心动图指标 后, 用 3%戊巴比妥钠 (30 mg/ kg) 耳缘静脉麻醉后, 经右颈 外动脉插管至左室, 测定左室舒张末压力, 在完成血流动力 学指标测定后, 立即开胸, 取出心脏秤取重量。然后, 立即心 脏灌流做电生理检查或切取左室远离梗死部位心肌组织
13、液 氮冻存备做 RT-PCR。 1. 3 家兔心室肌细胞的急性分离及电生理记录 1. 3. 1 家兔心室肌细胞的急性分离 按文献 4 采用酶解 法制备心室肌单细胞并进行了改进。耳缘静脉注射肝素 400 IU 后开胸, 迅速切取心脏, 置于冰冷 (4 ) 的无钙台氏 液中, 剪去心包, 心脏经修饰后连接在 Langendorff 心脏灌流 装置上, 经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流 (灌流压 70 cmH2O , 恒温 37 )5 10 min , 用含胶原酶 (Sigma 公 司, 0. 6 mg/ ml)和蛋白酶 XIV (Sigma 公司, 0. 1 mg/ ml) 的 无钙台氏液反复灌流
14、 8 15 min , 至心脏膨大, 松弛后, 用 KB 液灌流 5 min, 剪下左室置于 KB 液中剪成小碎块, 轻轻 吹打摇晃。逐步复钙至生理浓度 1. 8 mmol/ ml, 室温放置备 用。 1.3. 2 膜片钳全细胞钳制记录 选取大小适中、 形态完好、 边缘整齐、 表面无颗粒、 横纹清晰、 无收缩的细胞在室温下 (22 26 )进行实验。吸数滴细胞保存液加于 1 ml 灌流 槽中, 置于倒置显微镜 ( IX70 型, 日本 Olympus)载物台上。 细胞静置后沉底贴壁 8 10 min , 细胞外液灌流清洗细胞, 流速 1. 5 ml/ min。微电极 (中国科学院上海脑研所提供
15、) 由 PB27 型拉制仪 (日本 Narishige 公司)分两步拉制, 充灌电极 液后电阻为 2 5 M , 采用高阻抗封接技术, 负压打孔, 形 成全细胞钳制。pClamp 6 程序 (美国 Axon 公司)通过 AD/ DA 转换板 (Digidata 1200B , 美国 Axon 公司)支持膜片钳放 大器 (AXOPATCH200B , USA)进行刺激发放和信号采集, 并存储于计算机硬盘中。 1. 3. 3 溶液 无钙台氏液 (mmol/ L) :NaCl 135、 KCl 5. 4、 NaH2PO40. 33、 MgCl21. 0、 HEPES 10、 Glucose 10,
16、NaOH 调 pH 7. 3。KB 液成分 (mmol/ L) : KCl 40、 KH2PO420、 KOH 70、 MgCI23、 L-glutamic acid 50、 EGTA 0. 5、 Taurine 20、 HEPES 10、 Glucose 10, 用 KOH 调 pH 至 7. 3。记录 Ito的电极内液 (mmol/ L) : KCl 120、 CaCl21、 Na2ATP 5、 MgCl25、 EGTA 11、 HEPES 10, KOH 调 pH 至 7. 3 。记录 Ito的细胞外液为无钙台 氏液中加入 BaCl21 mmol/ L, 阻断 Ik1, 加入 CoCl2
17、2 mmol/ L 阻 断钙及钙激活的钾流。 1. 3. 4 膜电容测定及 Ito电流记录 吸破细胞膜进行膜电容 补偿后从放大器直接读取膜电容。保持电位于 - 80 mV, 施 予 -40 至 +70 mV 阶跃 10 mV、 脉宽 300 ms 的去极化脉冲, 记录 Ito。每一钳制电压下的平均电流密度绘制成电流-电压 (I-V) 曲线。 1. 4 RT-PCR 1. 4. 1 引物设计与合成 检索基因库 Kv1. 4、 Kv4. 3 和三磷 酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) , 设计并合成引物。Kv1. 4: 上游: 5AACAGTCACATGCCTTATG3, 下 游: 5 TTAGTAA
18、AACCT- TCCCTCCTC 3, 扩增片段 388bp;Kv4. 3: 上游: 5GAAGAG- GAGCACATGGGC3, 下游: 5GTGATCTGGGATGTTTTGC 3, 扩增 片 段 452bp;GAPDH:上 游: 5 GTGAAGGTCGGAGT- CAACG 3, 下游: 5GGTGAAGACGCCAGTGGACTC 3, 扩增 片段 299 bp。 1. 4. 2 总 RNA 提取 取组织块 50 100 mg 用液氮在研钵 中研磨成粉末, 移入玻璃匀浆器, 加入 1 ml Trizol 抽打匀浆, 冰上孵育 5 min 后离心 12 000 g 4 15 min,
19、取上清液移入 1. 5 ml 新离心管, 加 0. 2 ml 氯仿, 震荡, 冰上孵育 5 min。取 上层液相移入 1. 5 ml 新离心管, 加 0. 5 ml 异丙醇, 震荡, 冰 上孵育 5 min。离心 12 000 g 4 15 min 弃去上清液。加入 1 ml 75%乙醇, 震荡。离心 7 500 g 4 5 min, 弃去上清液。 室温下使之变透明。加入 DEPC 处理水 10 35l 溶解 RNA (可保存在液氮或低温冰箱) 。走 RNA 变性电泳观察 18 s, 28 s 条带, 分光光度计检测 260/280 吸光度比值, 计算 RNA 浓度 。 1. 4. 3 逆转录
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