急性肾衰竭与胎肝SCA1细胞向肾脏细胞的分化.pdf
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1、 4 2 1 文章编号 1 0 0 ( 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 4 2 1 一 0 6 急性肾衰竭与胎肝 S c a -1 + 细胞向肾脏细胞的分化关 廖继东, 张 泣 , ( 暨南大学医学院血液病学研究所, 姜锌 广东广州5 1 0 6 3 2 ) 摘要 目的: 研究急性肾衰竭( A R F ) 对胎肝 S e a - 1 十 细胞向肾组织细胞分化频率的影响。 方法: 用磁性细 胞分选( M A C S ) 和P C R 技术分离、 鉴定小鼠雄性胎肝S c a 一 1 + 细胞; 将2 x 1 护的雄性胎肝 s e a 一 1 细胞输注给致死量 射线照射(
2、 呷C o , 8 街) 的同 系 雌性小鼠 体内; 8 周后, 将受体小鼠 随 机分为A , B 和C 3 组( A 组: 单纯辐射; B 组: A R F 和C 组: A R F 一 S c a 一 1 + ) , 用5 0 %( V / V ) 的 甘油( 1 1 . 6 m Uk g ) 诱导B 组和C 组小鼠 产生A R F ; 7 2 h 后, 将新制备的2 x 1 护的雄性胎肝S e a 一 1 细胞输注给C 组小鼠。 8 周后处死全部实验小鼠, 取肾脏固定制片; 用 Y 染色体探针进行荧 光原位杂交( fl u o re s c e n c e i n s it u h y b
3、 ri d i z a ti o n , F I S H ) , 显微观察、 摄像并用专业软件进行图 像分析和数据处理。 结果: 在单纯辐射、 A R F 和A R F - S e a 一 1 + 3 种模型小鼠的肾小管上皮、 间质、 肾小球和肾小球边缘等部位, 均发现含Y 染色 体的细胞; 在A R F 和A R F - S c a 一 1 + 小鼠的肾组织切片中, 分别发现成对和成环状排列的含Y 染色体的细胞, 有组成 部分肾 小管的趋势; 胎肝S c a - 1 + 细胞在单纯辐射、 A R F 和A P J , 一 S c a - 1 3 种模型小鼠的肾组织切片中的分化频率 分别为(
4、1 . 6 5 士 0 . 1 8 ) %, ( 8 . 5 8 土 1 . 3 4 ) %和( 1 8 . 1 3 士 1 . 9 1 ) %, 后者与前者比较, 差别有显著意义( 尸 0 . 0 1 ) , 显示分化 频率伴随肾组织的损伤和再生而增加。 结论: 急性肾组织损伤和自 然再生的生理微环境有助于促进胎肝S c a - l * 细 胞向肾组织细胞的分化。 关键词 S c a 一 1 + 细胞; 胎儿肝; 肾功能衰竭, 急性; 小鼠 【 中图分类号 R 3 6 3【 文献标识码 A Di f f e r e n t i a t i o n o f S c a 一1 +c e l l
5、s f r o m mu r i n e f e t a l l i v e r i n t o r e n a l c e l l s i n mi c e wi t h a c u t e r e n a l f a i l u r e L I A O J i 一 d o n g , Z H A N G Y u a n , J I A N G H u a ( I n s t i t u t e of H e m a t o lo g y , M e d i c a l C o l le g e of J in a n U n i v e r s i ty , Ga n g z h o u
6、5 1 0 6 3 2 , C h in a ) A B S T R A C T A I M: T o s t u d y t h e e ff e c t o f a c u te re n a l f a i lu re ( A R F ) o n th e d iff e re n t ia t e d fr e q u e n c y o f S e a 一 1 + c e ll s fr o m m u r in e f e t a l li v e r i n i r r a d i a t e d m ic e . ME T H O D S : T h e S c a 一 1 +
7、 c e l ls f ro m m u r in e f e t a l l iv e r w e re is o l a t e d w i th m a gn e t ic c e ll s o rt - in g ( M A C S ) t e c h n i q u e , t h e s e x o f w h i c h w a s i d e n t if i e d 场P C R . T h e 2 x 1 0 S c a 一 1 十 。 e ll s w e re tr a n s p l a n te d in t o a l e t h a ll y i r r a d
8、 i - a t e d ( 6 0 C 6 , 8 G y ) i n b r e d f e m a le m o u s e . A f te r 8 w e e k s , th e s e r e c ip i e n t m i c e w e re d iv id e d t o A , B , a n d C g r o u p s a t r a n d o m ( A g ro u p : ir r a d i a t e d ; B g r o u p : A R F ; C g ro u p : A R F a n d S c a 一 1 + ) . T h e m i
9、c e i n B a n d C g ro u p s w e re i n d u c e d to A R F w it h 5 0 % ( V / V ) g l y c e r i n ( 1 1 . 6 m L/k g ) . 7 2 h o u r s l a te r , t h e m ic e i n C g ro u p w e re i n j e c t e d w i t h th e fr e s h p re p a r e d S c a 一 1 + c e ll s a g a i n . 8 w e e k s l a t e r , m i c e w
10、e re s a c r i f i c e d , a n d t h e i r k i d n e y s w e re ta k e n o u t , f ix e d a n d s l i c e s w e re p re p a r e d . F l u o re s c e n c e i n s i t u h y b r i d iz a - t i o n ( F I S H ) o f re n a l s l ic e s w a s p e r f o r m e d a n d th e p ic t u r e s o f t h e m w e re t
11、a k e n a n d a n a ly z e d . R E S U L T S : T h e c e l l s c o n ta in i n g Y c h r o m o s o m e w e re f o u n d i n re n a l s li c e s f ro m t h e m i c e i n A , B a n d C g ro u p s , w h i c h l o c a t e d i n e p i t h e l i a l c e ll s o f re n a l t u b u l e s , i n t e r - s t it
12、 i u m , g lo m e r u l i , a n d g l o m e r u la r m a r g i n a n d i n c re a s e d g r a d u a ll y . T h e d o u b le a n d e n c ir c le z o n e o f Y c h r o m o s o m e c e ll s w e re f o u n d i n t h e s l i c e s f ro m t h e m i c e i n B a n d C g r o u p s s e p a r a t e l y , w h i
13、 c h w a s c o n s i s t o f n e w re n a l t u b u l e s . T h e d i ff e re n t i a t i o n fr e q u e n c y o f S c a 一 1 c e ll s i n k i d n e y i n A , B a n d C g ro u p s w e re( 1 . 6 5 士 0 . 1 8 ) %, ( 8 . 5 8 士 1 . 3 4 ) %a n d ( 1 8 . 1 3 士 1 . 9 1 ) %, re s p e c t iv e l y , w h ic h s
14、 h o w e d s i g n if i c a n t d iff e re n c e b e tw e e n f o r m e r g ro u p a n d la t e r g r o u p ( P 0 . 0 1 ) . C O N C L U S I O N : T h e d i ff e re n t i a t i o n o f S c a 一1 * c e ll s f r o m m a r i n e f e t a l l i v e r i n t o re n a l c e ll s a n d t i s s u e i s p ro m o
15、 t e d 场p h y s i o l o g i c a l m i c r o e n v i ro n m e n t o f a c u t e d a m a g e a n d , - g e n e r a t i o n . 仁 K E Y WO R D S S c a 一 1 + c e ll s ; F e t a l l i v e r ; K i d n e y f a il u r e , a c u t e ; M i c e 近年不少研究者报道成体干细胞具有一定的可塑性, 可产生跨组织器官甚至跨胚层系统的分化现 收稿日 期 2 0 0 5 一 1 0 - 0
16、8 修回日 期 2 0 0 5 一 1 1 一 1 5 , 基金项目 暨南大学博士创新基金资助项目 通讯作者T e l : 0 2 0 一 8 5 2 2 0 2 6 2 ; E 一 二l : tz y u a n j n u . e d u . e n 4 2 2 . 象。如: 骨髓干细胞向肝实质、 肝胆管、 骨骼肌肉、 心 肌、 神经 、 肾 脏等 组织细 胞的 分化 2 l ; 肝脏干细胞 向 神经组织细胞的分化 3 ; 肌肉 川和神经 5 组织干 细胞向血液细胞的分化等。然而, 成年干细胞的横 向 分化研究目 前仍存在许多问题 6 , 分化频率低便 是其中之一。 在胚胎发育的一定时期,
17、 肝脏是造血器官, 含有 大量的造血干细胞。这些造血干细胞具有比骨髓干 细胞原始幼稚、 自我更新能力强、 免疫性低等优 点 7 , 是可供选择的 成年干细胞之一。其次, 已 有作 者提出干细胞的横向分化与局部组织的损伤程度和 修复的需要密切相关, 局部组织的损伤修复是诱导 干 细 胞 横向 分化的 重要条件 “ 。 在我们前期的实 验 显示小鼠胎肝 S e a 一1 + 细胞可分化为多种肾组织细 胞 9 的 基 础 上, 本研究采用甘油诱导急性肾 衰竭模 型 , 损 伤 实 验 小 鼠 的 肾 组 织 , 观 蔡 肾 衰 竭 是 否 影 响 胎 肝S e a 一 1 + 细胞向肾脏细胞的分化。
18、 材料和方法 1 制备雄性胎肝细胞悬液 1 . 1 制备胎肝细胞悬液 取C 5 7 B L / 6 j 小鼠( 购自 西安第四军医大学实验动物中心, 8 一1 2 周龄, 体重 1 8 一 2 0 g ) ; 雄性1 只与雌性两只同笼2 4 h , 然后移去 雄性小鼠, 妊期定为0 . 5 d 。于妊娠第1 4 . 5 d , 断颈处 死母鼠, 在无菌条件下剖腹取出胎鼠; 取出胎肝, 洗 去血液, 将其剪碎并移至含 1 0 % F C S 的R P M I 一 1 6 4 0 的1 0 M L 试管内; 用滴管反复冲吸, 尽力使肝组织分 离为单个细胞; 将试管中上部细胞悬液移至另一试 管内,
19、使其通过 6 号和4 号针头, 变成单细胞悬液; 加1 0 % F C S 的R P M I 一 1 6 4 0 于 前一 试管内, 用滴管反 复冲吸, 重复后一过程; 不能分解的组织被丢弃。合 并胎肝细胞悬液于同一个试管内, 离心, 用台盼蓝染 色记数活细胞, 用1 0 %F C S 的R P M I 一 1 6 4 0 调整细胞 浓度为2 x 1 0 6 . 1 . 2 制备胎鼠组织基因组D N A 取各胎鼠的胚胎 组 织约1 m g , 以缓冲液( 1 0 n u n o l / L T i i s l 1 0 m m o l / L E D T A , p H 8 . 0 ) 洗涤2
20、次, 然后以2 0 0 .L 裂解液 ( 2 0 m g / L 蛋白酶K , 0 . 5 % N P 一 4 0 和0 . 0 ,5 % T w e e n 4 0 ) 悬浮, 于6 0消化 1 5 m i n , 9 5以上5 m i n 灭活 蛋白 酶K , 1 2 0 0 0 x g离心5 m i n ( 4) , 收集含D N A 的上清液。 1 . 3 Y 染色 体防基因 扩 增 用P C R 扩增柳基因 片段, 引物序列: 8 2 1 5 一 8 2 3 5 5 一 A TT T I T A G T G TT C A G C C C T A C一 3 和8 6 3 9 一 86
21、5 95 一C T A C T C C A G T C T T G C C T G T A T 一 3 ; 以I L 一 3 基因片段作为内对 照, 引物序列: 2 9 0 一 3 0 9 5 一 G A A G A T G G C C TT T G A A T A A G一3 和 9 1 8一9 3 9 5 一A T A A C C C C A C T G A G A T A G A T ( ; 一 3 ( 由上海生物工程公司合成) 。反 应液组成: 1 x P C R缓冲液, 5 一 1 0 匹胎鼠 组织基因 组D N A , 2 . 0 m m o U L M g C 12 , 0 .
22、2 m m o U L d N T P , 2 . 5 U T a q 酶, 1 5 0 n m o U L各种引物, 总体积5 0 j .L 。在 P E 9 6 0 0 P C R 仪上, 先用9 4变性3 m i n 后, 按9 5 3 5 s , 5 64 0 s , 7 24 0 s 扩增 3 0 个循环, 再7 2 延伸3 m i n . 1 . 4 P C R产物的快速电泳分析取各胎鼠组织 D N A 扩增产物1 0 一 1 5 t .L , 点到含嗅化乙 锭的2 . 5 % 一 3 %的琼脂糖凝胶板上, 同时以标准分子量D N A 作 为参照, 在 1 2 一1 5 V / c
23、 m的电压下电泳 1 0 m i n , 在紫 外灯下观察电 泳结果( 防 基因片段为4 4 4 饰, I L 一 3 基因片段为6 4 9 b p ) , 确定细胞的 性别。 2 分离雄性胎肝 S c a 一1 + 细胞 用M A C S S c a 一 1 M u l t i S o rt K it ( 德国 美天 旎生物技 术有限公司) 试剂盒分离胎肝细胞悬液中的S c a 一 1 + 细胞。简言之, 将雄性胎肝细胞悬液混合, 用缓冲液 ( 0 . 5 % B S A 的P B S p H 7 . 2 ) 洗涤 并调整细胞浓度为1 x 1 0 8 c e l l s / 8 0 0 p
24、L , 加2 0 0 p .L S c a 一 1 M u l t i S o r t 磁珠混 匀, 置6 一 1 2冰箱孵育2 0 m i n , 加缓冲液至总体积 1 0 M L , 混匀, 2 0 0 x g 离心1 0 m in , 沉淀细胞加缓冲液 至1 M L , 混匀; 取m s + 分离柱, 用0 . 5 m L 缓冲液使柱 体浸透, 置于细胞分离器上, 将 1 M L 混匀的细胞悬 液缓缓加到准备好的M S + 分离柱上, 并用缓冲液洗 分离柱3 次, 每次0 . 5 m L , 使 S c a - 1 一 细胞完全通过 分离柱; 将洗涤后的M S + 分离柱从细胞分离器上取
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- 急性 衰竭 SCA1 细胞 肾脏 分化
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