应用重复序列PCR技术对嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型.pdf
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1、一7 8 一 重庆医 科大学学报2 0 0 6 年第3 1 卷第1 期 ( J o u r n a l o f C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e r s it y 2 0 0 6 . V o l .3 1 N o . 1 ) 文章编号: 0 2 5 3 - 3 6 2 6 ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 7 8 - 0 3 应用重复序列P C R技术对嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型 夏 云 , 李明爽“ ( 1 . 重庆医 科大学附属第一医院检验科, 重庆 4 0 0 0 1 6 ; 2 . 重庆合川市人民医院, 重庆 4 0 1 5 2
2、0 ) 摘要 目 的: 建立一种快速、 简便、 准确的基因分型方法, 对嗜麦芽窄食单胞菌的感染进行流行病学调查, 确定基因型与耐 药模式之间的相关性。方法: 选用肠杆菌科基因重复序列( E R I C ) 为引物进行P C R扩增, 对 1 4 株嗜麦芽窄食单胞菌进行基因 分型研究, 并与其抗生素耐药结果进行比较。结果: 1 4 株嗜麦芽窄食单胞菌呈现9 种耐药模式, 其中 1 3 株菌表现为5 种基因 型。 表明嗜麦芽窄食单胞菌的耐药模式和基因型之间无明确的相关性。 结论: E R I C - P C R应用简便易行, 重复性好, 适合于临床 分离的病原菌的分型及医院感染的分子流行病学研究。
3、 关键词】 嗜麦芽窄食单胞菌; 聚合酶链反应; 基因分型 【 中国图书分类法分类号 R 3 7 2【 文献标识码 A【 收稿日 期 2 0 0 5 一 0 8 一 2 9 G e n o t y p in g o f S t e n o t r o p h o m o n a s m a lt o p h il ia b y u s in g r e p e a t s e q u e n c e P C R X I A Y u n . , e t a l ( D e p a r t m e n t of C l i n i c a l L a b o r a t o r y , t h e
4、F i r s t A fl a t e d H o s p i t a l , C h o n g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ) A b s t r a c t O b j e c t i v e : T o e s t a b l i s h a r a p id , s im p le a n d a c c u r a t e g e n o t y p in g m e t h o d f o r t h e e p id e r m i c a l i n v e s ti g a t i o n o f n o s o c
5、 o m i a l i n f e c - t i o n c a u s e d b y S t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i a , a n d t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e g e n o t y p i n g a n d t h e d r u g - r e s i s t a n t p r o fi l e s Me t h - o d s : F o u r t e e n s t r a i n s o
6、 f S t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i a i s o l a t e d f r o m c l i n i c w e r e g e n o t y p e d b y t h e t e c h e n i c o f R e p - P C R w i t h t h e p r i m e r o f e n t e r o b a c t e r ia l r e p e t i t iv e i n t e r g e n ic c o n s e n s u s ( E R I C ) , a n d t
7、h e r e s u l t s o f R e p - P C R w e r e a n a l y z e d a n d c o m p a r e d w i t h t h e p a tt e rn s o f a n - t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y . R e s u l t s : A l l 1 4 s t r a i n s i n v o l v e d i n t h i s s t u d y e x h i b i t e d n i n e a n t i b i o t i c s u s c e
8、p t i b i l i t y p a t t e rn s . O f w h i c h 1 3 s t r a i n s e x h i b i t e d 5 d i f f e r e n t g e n o t y p e s .T h e r e w e r e n o d e fi n e d r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r e s u l t s o f t h e g e n o t y p i n g a n d t h e d r u g - r e s i s t a n t p r o fi l e
9、s . C o n c l u s i o n : T h e R e p - P C R t e c h e n i c u s e d i n t h i s s t u d y i s s i m p l e a n d r e p r e d u c i b l e f o r g e n o t y p i n g o f S t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i a . l t i s v a l u a b l e i n t h e m o l e c u l a r e p i d e m i o l o g i
10、c a l i n v e s t i g a t i o n o f n o s o c o m i a l i n f e c t i o n . K e y w o r d s S t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h il ia ; P o ly m e r a s e c h a in r e a c t io n ; G e n o t y p i n g . 嗜麦芽窄食单胞菌 ( S t e n o t r o p h o m o n a s m a l - t o p h i l i a ) 广泛存在于 土壤、 植物、 农副 产
11、品、 人体和动 物体表面, 属于条件致病菌。 当机体免疫受损、 免疫功 能低下、 长期接受广谱抗菌药物( 尤其是碳青霉烯类 抗生素) 治疗时, 可致严重感染川 。 由于该菌常对临床 大部分抗菌药物耐药, 给临床治疗带来极大困难2 1。 近 年来由该菌引起的医院感染明显上升,因此应当及 早诊断和进行流行病学调查,以便调整治疗方案和 采取相应的措施控制感染的流行。本文采用肠杆菌 科细菌基因间重复一致序列设计引物的聚合酶链反 应( E R I C - P C R ) 对嗜麦芽窄 食单胞菌进行分子流行 病学调查, 取得满意效果, 现报道如下。 1 材料和方法 作者介绍: 夏 云( 1 9 6 6 -
12、主要研 究方向 ) , 男, 副主任技师, 博士 : 医院感染与细菌耐药。 1 . 1 菌株收集和鉴定 所有菌株均分离自2 0 0 4 年8 月一 2 0 0 5 年5 月我院的 住院患者送检的标本, 种类包括痰液、 纤支镜抽吸物、 脓液、 导管等。 标本按常规方法接种血平板, 初筛试验为黄色湿润、 中大菌落、 革兰阴性杆菌, 0 / F 试验为非发酵型, 氧化酶试验 阴 性。 最后用A T B E x p r e s 、 细菌鉴 定系 统 ( 法国 生物梅里 埃) 鉴定为嗜 麦芽窄 食单胞菌( I D 9 0 %) 。 1 . 2 药敏试验 采用终点稀释法测定嗜麦芽窄食单胞菌对 T Z( 头
13、抱他 陡) ; P T C 呱拉西林/ 他哩巴坦) ; C I ( 环丙沙星 ) ; P M( 头 抱毗脂) ; T L C ( 替卡西林/ 克拉维酸) ; T S U ( 复方新诺明) ; C O L ( 多粘菌素) ; A K N ( 阿米卡星) ; I M I ( 亚胺培南) 等9 种 抗生素的耐药性。质控菌株为铜绿假单胞菌A T C C 2 7 8 5 3 , 结 万方数据 重庆医 科大学学 报2 0 0 6 年第3 1 卷第1 期 ( J o u r n a l o f C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e r s it y 2 0 0 6 .
14、 V o l.3 1 N o . 1 ) 一7 9 一 果判断参照N C C L S 标准( 2 0 0 4 版) 。 1 . 3 引物合成 采用与肠杆菌科细菌基因间重复一致序列互补的寡核 昔酸作E R I C - P C R扩增引物( E R I C 2 ) I ( 由大连宝生物工程 有限公司合成 ) 。序列如下: 5 - A A G T A A G T G A C T G G G G T G A G C G - 3 1 .4 细菌D N A提取和 P C R方法 嗜麦芽窄食单胞菌单个菌落转入2 m l L B 培养基3 7 培 养1 8 - 2 4 h 。 离心后去掉上清, 用生理盐水洗涤
15、沉淀1 次, 加人 蒸馏水1 0 0 8 1 , 混匀, 煮沸l O m in , 离心取上清液作为模板。 3 0 p , 1 反应体系中含1 0 x 缓冲液3 .0 N . 1 , M g C 12 2 .5 m m o l/ L , d N T P 各0 .2 5 m m o l/ L , 引物E R I C 2 l O p m o l , T a q 酶 ( 上海生 工) 2 U , D N A 模板4 .0 w 1 , P C R 反应条件为: 预变性9 4 0C 5 m i n 后, 设9 4 0C 1 m i n , 5 0 0C 1 m i n , 7 2 0 C 1 .5 m
16、i n , 共3 5 个循环, 最后 7 2 延伸5 m i n , P C R产物用 l . 5 % 琼脂糖凝胶在 I x T A E电泳 缓冲液中1 0 0 V电 泳0 .5 h , 澳化乙锭染色, 凝胶成像。 1 . 5 结果判断 D N A主条带数和位置完全相同者, 为同一基因型; 相差 一条者, 密切相关, 亦划为同一基因型; D N A条带相差2 条 或主条带位置不同者为不同基因型2 1 2 结果 2 . 1 1 4 株分离 菌的来源 和分布 该菌感染在临床各科均可出现, 在本试验中, 肺科6 例( 4 2 . 8 %) , 脑外科 6 例( 4 2 . 8 %) , 胸外科 1
17、例( 7 .2 %) , 外三科1 例( 7 .2 %) 。其中1 3 株均来 源于痰液, 仅胸外科 1 例来源于脓液。可见该菌主 要引起呼吸道感染, 从临床查阅的资料观察, 绝大 多数为下呼吸道感染且伴有较严重的基础疾病, 全 部病例均采用广谱或超广谱抗生素进行治疗, 部分 病例使用过两种或以上不同类别的抗生素治疗, 符 合医院感染诊断标准, 说明该菌为典型的条件致病 菌, 在医院感染中占 有重要地位。 2 . 2 药敏分型结果 嗜麦芽窄食单胞菌对所试9 种抗生素的耐药 率分别是: T Z 7 1 .5 %, P T C 8 5 .8 % , C I 7 1 .5 % , T L C 8 5
18、 . 8 % , T S U 7 .2 %, C O L 4 2 . 9 %, P M, A K N , I M I 均为 1 0 0 % 。由 此可见, 嗜麦芽窄食单胞菌对多种抗生素 耐药, 特别是对 R 一 内 酞胺类抗生素敏感率极低, 但该菌对磺胺敏感度相对较高。 1 4 株嗜麦芽窄食单 胞菌对9 种抗菌药物表现出9 种耐药模式, 结果见 表 1 。 2 . 3 基因分型结果 1 4 株嗜麦芽窄食单胞菌中有 1 3 株菌根据扩增 的D N A条带数和电泳位置可被分成4 个基因型, 分别描述为A , B , C , D型。第 1 1 株菌未能进行分 型, 可分型率为9 3 %( 1 3 /
19、 1 4 ) 。 其中 第 1 , 2 , 3 , 5 株为 A型, 第4 , 6 , 7 , 1 4 株为B型,第 1 0 , 1 2 , 1 3 株为C 表 1 1 4 株嗜麦芽窄食单胞菌的耐药模式及基因型 编号来源科室 C I P M T L C T S UC O L A K N I M I耐药模式基因型 R R S S S R R I A AABABBEDCCC IfllllWVWVI姐珊姗仪IX RRRRRRRRRRRR 1 0 1 1 2 1 3 脑外监护室 脑外监护室 脑外监护室 脑外监护室 脑外科 脑外科 肺科 外三科 胸外科 肺科 肺科 肺科 肺科 标本 痰 痰 痰 痰 痰
20、痰 痰 痰 脓痰 痰 痰 痰 痰 1 4月 币料淡HK K K n乃 n n n i v u _-一一-一 注: R耐药; S 敏感; N T 未能分型 万方数据 一8 0 一重庆医 科大学学报2 0 0 6 年第3 1 卷第1 期 ( J o u r n a l o f C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e r s it y 2 0 0 6 . V o l .3 1 N o . 1 ) 型, 第9 株为D型, 第 8 株为E型。 3 讨论 由于广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用, 由 嗜麦芽窄食单胞菌引起的医院感染近年来呈上升 趋势, 由于该菌的耐药机制
21、复杂, 对抗生素呈现多 重耐药, 在医院重症病房内定植和随后引起的感染 往往导致严重的后果。据B a r b i e r 报道, 在法国一家 医院中, 曾发现同一克隆株的嗜麦芽窄食单胞菌在 2 年内5 次造成医院不同科室的感染流行4 , 因此对 该菌进行流行病学监控尤为重要。 为了解嗜麦芽窄 食单胞菌的来源及流行情况, 本试验对我院的嗜麦 芽窄食单胞菌进行分子流行病学调查。利用 E R - I C - P C R对其进行基因分型结果表明, 1 3 株嗜麦芽 窄食单胞菌表现为 4 种基因型, 其中, 脑外科监护 室的流行株为A型, B 型为散发株,而肺科感染流 行株为B , C 两型, 两个病房
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