抗HLAG单克隆抗体G11E5的制备.pdf
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1、文章编号: 1007 -8738 (2006) 02 -0216 -02 抗 HLA-G 单克隆抗体 G11E5 的制备 陆盛军,梁智辉,朱慧芬,吴雄文*,龚非力(华中科技大学同济医学院免疫学系,湖北 武汉 430030 = ) 收稿日期: 2005 -03 -29; 修回日期: 2005 -05 -30 基金项目:国家自然科学基金重点项目资助 (No. 39830340) ;同济医 学院基础医学院基金资助项目 (2004 年度) 作者简介:陆盛军 (1976 - ) ,男,湖南永州人,讲师,博士生. Tel: (027) 83692611;Email:lushengjun sina. com
2、 *Corresponding author,Email:xiongwenwu hotmail. com 关键词 单克隆抗体;G11E5;HLA-G 中图分类号 R392. 45 文献标识码 A HLA-G 被推测能帮助细胞或组织逃脱免疫监视和排斥反 应,实现免疫耐受和逃逸 1。但也有一些证据持相反观 点 2, 3。因而,其功能的明确和对其发挥功能的机制的深入 研究,对实现移植耐受和有效的肿瘤治疗具有重要意义。本 研究中,建立了抗 HLA-G 单克隆抗体 (mAb) 的杂交瘤细胞 株,命名为 G11E5,经初步鉴定显示 G11E5 有 HLA-G 特异性。 1 材料和方法 1.1 免疫用抗原的
3、制备 按照 Pierce 公司的试剂盒 (Imject! Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit with mcKLH and BSA) 操作说明书将合成的多肽 (EEETRNTKAHAQTD RMN- LQTLRG,由美国 (西安) 美联生物科技公司合成) 偶联到载体 蛋白质上。偶联产物过柱纯化,用考马斯亮兰 G-250 法或 280 nm 微量直接比色法测定蛋白质浓度后分装,-40保存 备用。多肽-KLH 偶联物用于免疫小鼠,多肽-BSA 偶联物用 于检测小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水 mAb 的效价。 1. 2 mAb 的制备 分离经
4、3 次免疫的 BALB/ c 小鼠脾细胞 与 Sp2/0 细胞采用聚乙二醇 (PEG) 常规方法进行融合。对 ELISA 检测的阳性克隆使用有限稀释法进行亚克隆,直至有 克隆生长的孔的阳性率达到 100%。杂交瘤上清 mAb 效价检 测采用间接 ELISA 4。杂交瘤细胞经 PBS 洗涤后重悬,以 0. 5 106 5 106个/ 只腹腔注射,经过 9 d 后收集小鼠腹 水,-20保存备用。 1. 3 mAb 特性分析 mAb 细胞株的遗传学的鉴定用普通染 色体制片法制片后显微镜下染色体计数。抗体敏感性鉴定的 测定用 mAb 的腹水按 1: 531: 510稀释后做间接 ELISA 试验。 m
5、Ab 特异性分析用 JEG-3 细胞株和外周血淋巴细胞 (PBL) 经 40 g/ L 多聚甲醛固定后进行流式细胞术 (FCM) 检测和荧光显 微镜检测 4。 2 结果 2. 1 多肽与载体蛋白偶联结果 图 1 是根据其中一次偶联 产物经过柱纯化后的洗脱曲线图 (趋势图) ,证明纯化成功。 图 1 偶联产物洗脱曲线 2. 2 mAb 的制备结果 本研究中,共免疫 6 只 BALB/ c 小 鼠,融合前免疫双扩检测效价结果为:1: 16、1: 8、1: 2 各 2 只。取其中 1 只效价为 1: 16 的小鼠脾细胞与 Sp2/0 融合、筛 选、克隆化后得到 1 株稳定分泌抗体的杂交瘤,命名为 G
6、11E5。 2. 3 mAb 特性分析结果 G11E5 的染色体众数为 93。间接 ELISA 测定此 mAb 腹水的敏感性为 1 56。图 2 显示,G11E5 只识别 HLA-G 分子而不识别人的外周血淋巴细胞 (PBLs) 上 的其他经典的 HLA-“类分子;图 3 FCM 结果显示,用 G11E5 检测出 JEG-3 的阳性率为89%,而 PBL 的阳性率只有6. 8%。 以上初步说明此株 mAb 具有 HLA-G 特异性。 图 2 用 G11E5 间接免疫荧光染色后的细胞照片 A:JEG-3 细胞;B:PBLs 细胞. 3 讨论 HLA-G 在蛋白结构上与其他 HLA-“类分子高度同
7、源。 我们选择一段与其他 HLA-“类分子同源性较低、在 HLA-G 等位基因产物中尚未发现有多态性的肽段作为抗原制备抗 HLA-G 的 mAb。这段肽位于构成 HLA-G 的抗原结合槽的 #1 (下转 218 页) 612ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2006, 22 (2) 3 讨论 Uu 是 Shepard 6于 1954 年首次从非淋球菌尿道 炎患者的尿道分泌物中而分离获得的,曾称为 T-支 原体 (T-mycoplasmas) 属于支原体科脲原体属。正常 人尿道中有时也可分离到 Uu,其致病性与血清型别 有关,
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