抗原特异性调节性T细胞体外诱导扩增及其功能测定.pdf
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1、in vitro and amplified. Then the MSCs, rhBMP2 and Fibrinogen were made into a complex and implanted into 5 allo- genic rabbits to bridge 1. 5cm segmental bone defects as experiment group. Fibrinogen was implanted to bridge same size defects in other 5 allogenic rabbits as control group. The CD4 + ,
2、CD8 + , CD4 + / CD8 + T lymphocytes in blood were detected using flow cytometer at 1, 2, 3, 6 and 8 weeks after the operation. Results T lymphocyte subsets CD4 + , CD8 + and CD4 + / CD8 + at every time point after the operation in the experiment group and control group had no significant difference
3、as compared to pre-operation. Conclusion Tissue engineered bones constructed with Fibrinogen, and rhBMP 2 and allogenic MSCs showed low immunogenicity within 8 weeks and could be implanted to repair bone defects in rabbits. MeSH tissue engineering; bone transplantation; transplantation, homologous;
4、t-lymphocyte subsets/ blood;rabbits 抗原特异性调节性 T 细胞体外诱导扩增及其功能测定 陈 跃, 许戈良, 王保龙 摘要: 目的 体外诱导扩增抗原特异性 CD4 + CD25 + T 细胞, 测定其免疫抑制功能, 验证其抗原特异性。方法 应用免疫 磁珠 法 ( MACS)分 选 C57BL/6 鼠 CD4 + CD25 + T 细 胞。 CD4 + CD25 + T 细胞在 Balb/ c 鼠抗原刺激条件下, 体外扩增 获得 Balb/ c 鼠抗原特异性的 CD4 + CD25 + T 细胞 (iCD4 + CD25 + T) , 流式细胞术测定其纯度,RT
5、-PCR 方法测定其 FoxP3mRNA。测定在 Balb/ c 小鼠 (A 组) 或昆明鼠 (B 组) 抗 原刺激条件下, iCD4 + CD25 + T 抑制 T 细胞增殖的效率, 验证 iCD4 + CD25 + T 的抗原特异性。ELISA 法测定 A、 B 组上清液 中 IL-10 和 TGF- 的含量。结果 MACS 分离的 C57BL/6 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞纯度为 99. 6%。扩增 3 周, iCD4 + CD25 + T 纯度达 85%, 扩增数目达 900 倍, 高表达 Foxp3 基 因。当 iCD4 + CD25 + T : CD4 + CD25
6、- T 为 1 : 1、 1 : 2 时, A 组抑制率明显高于 B 组 (82. 2% 3. 29% vs 11. 6% 1. 2%, 54. 4% 3. 5% vs 5. 4% 1. 7% , P 0. 01) 。A 组 IL-10 和 TGF- 的分泌量均高于 B 组 (P 0. 01) 。结论 在 体外成功诱导扩增了具有免疫抑制功能的抗原特异性的 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞。 主题词 小鼠; T 淋巴细胞亚型; 抗原; 流式细胞术 中图分类号 R 392. 4 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 (2006) 04 -0395 -04 CD4 + T 细胞的
7、一种亚群持续表达 IL-2 受体的 链 (CD25) , 其在控制自身免疫病中起重要作 用 1 -2, 移植时输注这种细胞可以诱导异基因移植 鼠的免疫耐受 3。这种 CD4+ CD25 + T 细胞被称作 2006 -05 -30 接收 作者单位: 安徽医科大学附属省立医院普外科, 合肥 230001 作者简介: 陈 跃, 男, 32 岁, 硕士研究生, 医师; 许戈良, 男, 50 岁, 主任医师, 硕士生导师, 责任作者, E- mail :xugelian mail. hf. ah. cn 调节性 T 细胞 (Tr) 。在人和鼠 CD4 + CD25 + T 细胞 占 CD4 + T 细
8、胞的 5% 10%1, 数量少, 单一个体 无法提供治疗剂量的 CD4 + CD25 + T 细胞。此外, CD4 + CD25 + T 的效应功能是抗原非特异性的, 如何 高效诱导抗原特异性的 CD4 + CD25 + T 细胞以用于 特异性的免疫治疗是亟待解决的又一难题。本实验 采用混合淋巴反应技术扩增 C57BL/6 (B6) 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞: 用灭活的 Balb/ c 小鼠抗原提呈 细胞 (APC) 作为刺激抗原, 在含大剂量 mIL-2(100 g/ L) 、 mIL-10(100 g/ L) 的 RPMI 1640 培养液中 培养扩增, 3 周后计扩增的
9、CD4 + CD25 + T 细胞数确 定其扩增效率, 并用 T 细胞增殖抑制实验测定其抑 制功能和抗原特异性。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 B6 (H-2b) 、 Balb/ c (H-2d) , 雄性, 8 10 周龄, 各 8 只 (购自安徽医科大学动物中心, 清 洁级) 。 1. 2 主要试剂及仪器 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞磁 珠分离试剂盒、 小鼠 CD4 - FITC 单抗及小鼠 CD25 - PE 单抗 (Miltenyi Biotec 公司产品) ; mIL-2、 mIL-10、 IL-10 及 TGF-ELISA-Kit (Pepro inc 产品) 流
10、式细胞 仪 (FACSCalibur 型, Becton Dickinson 公司产品) ; H3-TdR (中国同位素公司产品) 。 1. 3 方法 1. 3. 1 脾脏单个核细胞的分离 断颈处死 B6 或 Balb/ c 小鼠, 取脾脏, Ficoll 离心分离获得单个核细 胞。 1. 3. 2 免疫磁珠法 (MACS) 分选 CD4 + T 细胞、 APC 593安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug; 41 (4) 用含 0. 5%牛血清白蛋白、 pH 7. 2 的 PBS 缓冲液 40 l 重悬脾细胞, 加入10
11、l 混合生物素抗体 (含 anti- mouse CD8a、 CD11b、 CD45R、 CD49b、 Ter-119)4 8放置 15min, 再加 20 l 抗生物素磁珠、 10 l CD25-PE 单抗 4 8放置 15 min, LD 柱过滤, 阴性 选择获得 CD4 + T 细胞, 快速挤压出 LD 柱中细胞, 20 Gy 照射后作为 APC。 1.3. 3 MACS 分选 CD4 + CD25 + T 细胞 CD4 + T 细 胞重悬后加抗 PE 磁珠4 8 放置 15 min, 经 2 次 MS 柱过滤, 阳性选择获得 CD4 + CD25 + T 细胞。所 得 CD4 + CD
12、25 + T 细胞加入 CD4-FITC 单抗和 CD25- PE 单抗避光混合 30min, 流式细胞术测定其纯度。 1. 3. 4 体外扩增 Balb/ c 鼠抗原特异性 iCD4 + CD25 + T 3. 5 104/100l, B6 小鼠 CD4 + CD25 + T 细 胞在含 B6 鼠 APC(20Gy 照射) 2 105/50 l 和 Balb/ c 鼠 APC (20 Gy 照射) 2 105/50 l 的 RMPI 1640 培养液 (含 100 g/ L IL-2,100 g/ L IL-10, 10% FCS,50 mol/ L -巯基乙醇)中, 置于 5% CO2孵箱
13、培养扩增, 每 2 天半量更换新鲜培养液。 每 7 天 1 : 1扩孔后重新刺激, 第 21 天收集细胞。 1. 3. 5 细胞表型的鉴定 扩增后细胞经 PBS 洗涤 3 次后, RMPI 1640 培养液重悬至 1 106/ ml, 0. 4% 台盼蓝染色( 细胞悬液与 0. 4%台盼蓝染色按1 : 1 比例 ), 计未被染色的活细胞绝对总数。CD4-FITC 单抗和 CD25-PE 单抗与细胞悬液避光4 孵育 30 min, 流式细胞术测定扩增后 CD4 + CD25 + T 细胞纯 度。 1. 3. 6 Foxp3 mRNA 的测定 分别取扩增的 CD4 + CD25 + T (iCD4
14、 + CD25 + T) 、 新分离的 CD4 + CD25 + T (f-CD4 + CD25 + T) 、 CD4 + CD25 - T 细胞、 外周血单个 核细胞 (SMC) 、 脾脏单个核细胞 (PBMC) , 加入 1 ml Trizol 提取总 RNA, 根据逆转录试剂盒提供的方法 将总 RNA 反转录为 cDNA, 以其为模板进行 PCR 扩 增。PCR 反应条件为: 94 预变性 2. 5 min, 然后 94 变性 30 s, 60 退火 30 s, 72 延伸 1. 5 min, 共 35 循环。FoxP3 基因引物序列 P1: 5-CTCCCG- GCAACTTCTCCT
15、GAC-3,P2: 5- TCAAGGGCAGG- GATTGGAGCACT-3。GAPDH 引 物 序 列 P1: 5 - GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3,P2:5-GAAGAT GGT GAT GGG ATT TC-3。均由大连 TaKaRa 公司 合成。 1. 3. 7 T 细胞增殖抑制试验 A 组:在 96 孔反应 板中加入 B6 小鼠 CD4 + CD25 - T 细胞 1 105/ 孔, B6 小鼠 APC (20 Gy 照射) , Balb/ c 小鼠 APC (20 Gy 照射) 1 105/ 孔, 再按不同比例 (iCD4 + CD25 + T : CD4 + C
16、D25 - T 为1 : 1、 1 : 2、 1 : 4、 1 : 8) 加入扩增后 的 iCD4 + CD25 + T。B 组:在 96 孔反应板中加入 B6 小鼠 CD4 + CD25 - T 细胞 1 105/ 孔, B6 小昆鼠 APC (20 Gy 照射) , 昆明小鼠 APC (第三方对照刺激细 胞, 20 Gy 照射) 1 105/ 孔, 再按不同比例 (iCD4 + CD25 + T : CD4 + CD25 - T 为1 : 1、 1 : 2、 1 : 4、 1 : 8) 加入扩增后的 iCD4 + CD25 + T。 每组均设阳性对照(即该组反应体系中不加 iCD4 + C
17、D25 + T) , 每组 5 只小鼠, 每个反应重复孔, 在含10% FCS、 50 mol/ L -巯基乙醇的 RMPI 1640 培养液中, 37 、 5% CO2环境中培养 96 h。终止培 养前 16 h 加入18. 5 Bq 的 H3-TdR, 多头细胞吸收器 收集细胞, -液闪仪 (BeckmanLS6500) 测定 cpm 值。 计算各组抑制率。 抑制率% = (1 - 测定组 cpm/ 阳性组 cpm)100% 1. 3. 8 TGF-、 IL-10 的测定 分别于 T 细胞增殖 抑制试验细胞培养的 12、 24、 48、 72 h 收集上清液, -80 保存。测定严格按说明
18、书要求进行。 1.4 统计学处理 数据以%x s 表示, 用 SPSS 11. 0 软件进行配对 t 检验分析。 2 结果 2.1 CD4 + CD25 + T 细胞纯度分析 MACS 分选的 CD4 + CD25 + T 细胞纯度达到 99. 6%, 扩增 3 周后 CD4 + CD25 + T 细胞纯度为 85%。见图 1。 图 1 CD4 +CD25+T 细胞纯度分析 A: CD4 + CD25 + T 细胞纯度达 99. 6%; B: 扩增 3 周后 CD4 + CD25 +T 细胞占总细胞数的 85% 2. 2 CD4 + CD25 + T 细胞扩增效率分析 收集扩 增后的细胞, 重
19、悬细胞后台盼蓝染色, 计活细胞绝对 总数为 10. 8 107, 相对培养前的 1. 05 105(3 孔总 数) ,CD4 + CD25 + T 细胞扩增效率约为 900 倍 (10. 8 1070. 85/1. 05 105) 。 2. 3 各组细胞 Foxp3 的表达 f-CD4 + CD25 + T、 693安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug; 41 (4) iCD4 + CD25 + T 均高表达 Foxp3 基因, 而新分离的 CD4 + CD25 - T 细胞不表达该基因。PBMC、 SMC 表 达少量 F
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- 抗原 特异性 调节 细胞 体外 诱导 扩增 及其 功能 测定
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