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1、陕西医学杂志 2 0 0 6 年 4 月第 3 5 卷第 4 期 4 0 7 左旋精氮酸抑制人血管平滑肌细胞合成胶原的作用 河南省郑州大学第一附属医院急救中心( 郑州4 5 0 0 5 2 )李飞飞党瑜华刘瑞云 摘要目的: 探讨内皮素( E T - 1 ) 对人血管平滑肌细胞( H VS MC ) 合成胶原的影响 并观察左旋精氛酸( L - a r g i n i n e ) 对H V S MC合成胶原的影响。方法: 将E T - 1 1 0 -e m o l / L和 不同浓度L - a r g i n i n e 加入体外培养H V S MC 。 培养2 4 h 之后刚培养液中N O含童,
2、 浏细胞内 c G MP含量及3 H - )W 氮酸掺入童即总胶原含童。 结果: 加入梯度浓度1 = a r g i n i n e , N O水平呈 剂量依赖性增加( P均0 . O 1 ) ; E T - 1 使胶原合成量增加 8 0 0 o ( P0 . 0 0 1 ) , 加入梯度浓度 L - a r g i n i n e 较E T - 1 组胶原合成量分别减少了3 7 0 0 , 4 1 %, 5 6 %( P均0 . 0 1 ) , 呈剂量依赖 性; E T - 1 +L - a r g i n i n e 低、 中、 高浓度组较 E T - 1组细胞内c G MP含量明显增加(
3、 尸均0 . 0 1 ) , 且c G MP 含量随L - a r g i n i n e 增加而增加; 细胞内c G MP 含量与胶原合成量呈良 好负相 关关系( r =- 0 . 9 3 ) 。结论: E T - 1 可引起H V S MC合成胶原增多; L - a r g i n i n e 可剂量依赖地 抑制H V S MC合成胶原; L - a r g i n i n e 对胶原合成的抑制作用可能是通过c G MP途径起作用。 主题词细胞/ 病理学肌, 平滑, 血管内皮缩血管肤类/ 药物作用精氮酸/ 药物作 用 L - a r g i n i n e i n h i b i t s
4、c o l l a g e n s y n t h e s i s i n h u ma n v a s c u l a r s mo o t h mu s c l e c e l l s D e p a r t m e n t o f E m e r g e n c y , t h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l , Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y ( Z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2 ) L i F e i f e i D a n g Y u h u a L
5、 i u R u i y u n A B S T R A C T O b j e c t i v e : T o s t u d y t h e e f f e c t o f E T - 1 o n c o l l a g e n s y n t h e s i s o f c u l t u r e d H V S MC , t o o b s e r v e t h e e f f e c t o f L - a r g i n i n e o n E T - 1 i n d u c e d c o l l a g e n s y n t h e s i s o f H V S MC a
6、 n d t o e x p l o r e t h e m e c h a n i s m o f p r e v e n t i n g R S b y L - a r g i n i n e . Me t h o d s : H V S MC w e r e c u l t u r e d i n v i t r o . T h e H V S MC w e r e a d m i n i s t e r e d E T - 1 ( 1 0 -e m o l / L ) a n d L - a r g i n i n e o f d i f f e r e n t c o n l e n
7、 t r a t i o n . T h e m e d i u m w a s c o l l e c t e d a f t e r 2 4 h o u r s t o d e t e r m i n e N O . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d a t t h e s a m e t i m e t o a s s a y c G MP c o n t e n t . T h e m e d i u m a n d t h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d s e p a r a t e l
8、y t o d e t e r m i n e c o l l a g e n . R e s u l t s : T h e l e v e l o f N O w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n E T - 1 - 1- L - a r g i n i n e g r o u p c o m p a r e d w i t h t h a t i n E T - 1 . g r o u p ( P 0 . 0 1 ) T h e c o l l a g e n l e v e l i n E T - 1 g r o u
9、 p w a s i n c r e a s e d b y 8 0 % c o m p a r e d w i t h t h a t i n C g r o u p ( P 0 . 0 0 1 ) . Wi t h L - a r g i n i n e a d d e d i n g r a d i e n t c o n c e n t r a t i o n s , t h e p r o d u c t i o n o f c o l l a g e n w a s d e c r e a s e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p
10、e n d e n t f a s h i o n : 3 7 0 o , 4 1 % a n d 5 6 %, r e s p e c t i v e l y ( P a 1 1 0 . 0 1 ) .T h e l e v e l o f c G MP i n E T - 1 +L - a r g i n i n e g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n E T - 1 g r o u p ( P a 1 1 0 . 0 1 ) . L i n e a r c o r r e l
11、a t i o n : T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e l e v e l o f c G MP a n d t h a t o f c o l l a g e n ( r =- 0 . 9 3 , P 0 . 0 1 ) . C o n c l u s i o n : E T - 1 i n c r e a s e d t h e s y n t h e s i s o f c o l l a g e n i n H V S MC
12、, w h i c h w a s a n i m p o r t a n t c a u s e o f i n t i m a l h y p e r p l a s i a i n R S . L - a r g i n i n e i n h i b i t e d s y n t h e s i s o f c o l l a g e n o f H V S MC i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t f a s h i o n , t h u s i t c o u l d i n h i b i t i n t i
13、 m a l h y p e r p l a s i a . L - a r g i n i n e i n h i b i t e d p r o d u c t i o n o f c o l l a g e n , d u r i n g w h i c h t h e s i g n a l i n g m o l e c u l e c G MP p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n m e d i a t i n g t h e i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d
14、u c t i o n . K E Y WO R D S C e l l s / p a t h o l o g y Mu s c l e , s m o o t h , v a s c u l a r E n d o t h e l in s / d r u g e f f e c t s A r g i n i n e / d r u g e f f e c t s 4 0 8陕西医学杂志2 0 0 6 年 4 月第 3 5 卷第 4 期 血管介人损伤后再狭窄( R e s t e n o s i s , R S ) 成 为影响血管成形术疗效的最大障碍, 血管再狭窄 机制与血管内膜增生及血
15、管重塑有关, 上述病理 变化是多种生长因子共同参与作用的结果。以往 对内皮素( E n d o t h e l i n - 1 , E T - 1 ) 及一氧化氮( N i t r o o x i d e , N O) 的认识局限于对血管平滑肌细胞 ( V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , V S M C ) 增殖的 影 响。本研究主要观察 E T - 1 对人血管平滑肌细胞 ( H V S MC ) 合成胶原的影响, 建立 H V S MC再狭 窄模型, 并以左旋精氮酸( L - a r g i n i n e , L - A
16、 r g ) 作 为 N O前体观察对胶原合成的影响及其作用机 制, 为临床防治经皮冠状动脉成形术( P T C A) 术 后R S提供理论依据。 材料与方法 1 药品与试剂 E T - 1 , L - A r g 均购自 美国 S i g m a 公司; N O试剂盒为南京聚力生物试剂开 发公司产品; c G MP试剂盒为上海中医药大学同 位素室产品 2细胞培养H V S MC原代培养。取自于 水囊引产胎儿胸主动脉段, 无菌操作下取材, 分离 血管中膜并剪成小块放于 5 0 m 1 卡式培养瓶中培 养。 待原代细胞生长至单层融合后传代培养。 将 6 - 1 0 代细胞传代于 2 4 孔培养板
17、, 种植密度为 1 0 5 个细胞/ m l , 培养于含 1 0 %胎牛血清( F C S ) 的 D ME M 培养基中, 细胞生长至基本融合, 用无血 清培养基静息 2 4 h后分为 5组: 1组为对照组( , =1 0 ) , 培养液中不加干预药物; 2 组为E T - 1 组( , =1 0 ) , 培养液中加人E T - 1 1 0 - e m o l / L ; 3 组为L - a r g i n i n e 低浓度组( n =1 0 ) , 培养液中加人 E T - 1 1 0 e m o l / L和L - a r g i n i n e 4 X 1 0 - 3 m o l
18、/ L ; 4 组为L - a r g i n i n e中浓度组( 二 =1 0 ) , 培养液中加人 E T - 1 1 0 - B m o l / I 一 和L - a r g i n i n e 1 . 2 X 1 0 “ Z m o l / L ; 5 组为 L - a r g i n in e 高浓度组( n =1 0 ) , 培养液中加人E T - 1 1 0 - e m o l / L和L - a r g i n i n e 2 X 1 0 - Z m o l / L , 3 N O检测按以上各组加人不同干预药 物培养 2 4 h , 收集各孔培养液, 硝酸还原酶法测 N O含
19、量 4 胃蛋白酶消化法测定细胞胶原合成以 上各组静息的H V S MC加人含有所需药物和3 H - 脯氮酸( 7 4 k 鞠/ m l ) 的培养液( 1 m 1 ) , 于 3 7 培养 2 4 h后收集各孔培养液加人试管中, 然后依次加 人 2 5 u l 5 mo l / L醋酸, 2 5 u l 胃蛋白酶, 5 0 u l 未标记 的脯氮酸, 混匀后于 4 0C 静! 3 h , 再加人 2 5 0 川 4 预冷的1 . 2 m o l / I , 过抓酸, 反应 2 h后, 将反应 液中未被消化的胶原蛋白收集, 进行液闪侧定, 以 检侧培养基中胶原蛋白的含盘。细胞移出培养板 后, 收
20、集进行液闪测定, 以检侧细胞内胶原的含 量, 总胶原生成量为培养液和细胞内胶原生成量 之和。 另以相同的培养条件培养细胞, 计算各组每 孔细胞的数目。 5 c G MP检测按以上各组加人不同干预 药物培养 2 4 h , 吸弃培养液, 加人孵育缓冲液, 其 组 成 如 下 ( mmo l / L) : Na C l 1 3 7 . 0 , K C l 7 . 0 , N a , H P O , 8 . 0 , K H 2 P O , 1 . 5 , C a C I Z 0 . 5 , Mg C 1 2 0 . 5 , z a p r i n a s t 0 . 1 , 3 - i s o b
21、u t y l - l - m e t h y l x a n t h i n e 1 , 继续在各组的不同条件下培养 l h后取样本, 按说 明书测定细胞内c G MP含量。 6 统计学处理数据用均数士标准差( x 士 s ) 表示。采用两样本均数比较的t 检验, 多个样本 均数间两两比较的方差分析和4 检验, 不同指标 比较的直线相关分析, 对相关系数 r 进行 t 检验, S P S S软件对实验结果进行统计学处理。 结果 1培养液中N O 的含It变化E T - 1 组 N O的含量为9 5 . 5 0 士7 . 4 7 k m o l / L 。 与E T - 1 组相 比较, 各不
22、同E T - 1 +1 = a r g i n i n e 组N O含量显著 升高 ( 与 E T - 1 组相比, P均0 . 0 1 ) , 且 N O含 量随L - a r g i n i n e 剂量的增加而增加。 2各组H V S MC合成胶原的变化以 H - 脯氮酸掺人量表示胶原含量, E T - 1 组胶原含量 较对照组显著增加了 8 0 0 o ( P0 . 0 0 1 ) . E T - 1 十 L - a r g i n i n e 低、 中、 高浓度组胶原含量较E T - 1 组 显著减少, 分别减少了3 7 写, 4 1 %, 5 6 %( 与E T - 1 组 相 比
23、, P 0 . 0 1 ) , 表 明 L - a r g i n i n e可抑 制 H V S MC合成胶原, 并呈剂量依赖性。 3细胞内c G MP含女的变化E T - 1 + L - a r g i n i n e 低、 中、 高浓度组c G MP含量较E T - 1 组 显著增加, 分别增加 T 1 8 0 0 0 , 3 4 9 0 0 , 5 2 6 0 0 ( 与 E T - 1 组相比, P均0 . 0 0 1 ) , 结果表明L - a r g i n i n e 可引起 c G MP含量 增高, 且 c G MP含量 随 L - a r g i n i n e 剂量的增加
24、而增加。 4细胞内。 G MP含!与H V S MC合成胶原 I的相关性细胞内c G MP含量与H V S MC合 成胶原量呈显著负相关, 随细胞内c G MP含量增 陕西医学杂志2 0 0 6 年 4 月第 3 5 卷第 4 期 4 0 9 _ _-份r 一一一-币 一一一一-.- 、 - 一 一 ,一 一-一一.一一, 一一 _ 加, V S MC合成胶原量减少。相关系数r 为一 0 . 9 3 ( P 0 . 0 1 ) 。 讨论 在P T C A术后再狭窄形成过程中, E T - 1可 能是一个重要的始动因素, 与细胞外基质合成有 密切关系。P T C A术后内皮受损, E T - 1
25、 释放量明 显增加, 冠状窦处血浆中E T - 1 含量明显增高E l l 0 动物 实 验 研 究 发 现,P T C A 术 后 口服 B S F 2 0 8 0 7 5 ( E T受体拮抗剂) 后可减轻内膜的形 成, 与对照组相比, 可减轻 0 % 2 15 y 。我们培养 H V S MC进行实验, 结果表明: 用剂量为 1 0 e m o l / 1 . 的E T - 1 能显著地促进 H V S MC合成胶原, 使 总胶原含量升高, 证实了P T C A术后 E T - 1 含量 升高是引起合成胶原增多的一个重要机制。 目 前认为, N O与再狭窄有密切关系。 实验研 究发现, 动
26、脉内皮损伤后, N O的产生显著减少 3 1 给予球囊损伤后再狭窄动物添加补足 N O供体 S i n - 1 , 结果发现, 血管内膜增厚被抑制, 甚至趋于 消退 4 1 。最近还有报告, 将内皮型N O S基因导人 球囊损伤血管后的动物, 损伤诱发的细胞生长及 新内膜形成能够得到抑制, 防止或减轻了再狭窄 的发生 5 1 。本实验的研究结果表明L - A r g 通过释 放N O能显著抑制细胞胶原合成, L - A r g低、 中、 高浓度组与 E T - 1 组相比3 H- 脯氨酸掺人量即胶 原合成量下降, 分别下降了 3 7 纬, 4 l 0 o , 5 6 0 o , 呈 剂量依赖性
27、。 L - A r g 作为一种临床应用广泛的药 物, 不良反应少, 有很好的应用前景。 目前, N O抑制细胞合成胶原的机制尚不清 楚。 c G MP在细胞内起重要第二信使作用, 参与血 管舒缩、 血管活性物质的自分泌和旁分泌、 细胞增 殖、 细胞表型等许多重要功能的调节。 NO主要通 过c G MP及非。 G MP途径而发挥其生物作用。目 前认为, c G MP有抑制细胞合成胶原的作用, 作为 一个重要的信使分子, 在调节再狭窄的形成过程 中发挥着重要作用。 体外实验发现, 在细胞培养液 中加人 8 - B r - c G MP ( c G MP的模拟物质) 后, 细胞 合成的胶原量明显下
28、降E 3 . C h u A J 也观察到同样 现象, 而且加人美甲兰( c G MP的拮抗物质) 后, 细 胞合成的胶原量回升川。 本实验发现, 细胞内c G MP含量与胶原合成 量之间有良好的线性关系, 表明c G MP与胶原合 成量有密切关系, 提示L - A r g 抑制胶原的作用可 能与c G MP途径有关。 本实验结果表明L - A r g 可有效抑制H V S MC 胶原的合成, 其机制可能与C G MP途径有关, 关于 c G MP如何抑制V S MC合成胶原的机制有待进 一步研究。L - A r g有可能成为一种有效的再狭窄 防治药物。 参考文献 1 T a k a s e
29、H, S u g i y a m a M, N a k a z a w a A , e t a l . I n c r e a s e d e n d o g e n o u s e n d o t h e l i n - 1 i n c o r o n a r y c i r c u l a t i o n i s a s s o c i a t e d wi t h r e s t e n o s i s a f t e r c o r o n a r y a n g i o p l a s t y . C a n J C a r d i o l , 2 0 0 3 ; 1 9 ( 8 )
30、 : 9 0 2 2 K i r c h e n g a s t M. E n d o t h e l i n r e c e p t o r b l o c k a d e a n d i n - s t e n t r e s t e n o s i s . J C a r d i o v a s c P h a r ma c o l ,2 0 0 1 ; 3 8 .S 3 1 3 T h o l l o n C , F o u r n e t - B o u r g u i g n o n MP , S a b o u r e a u D , e t a l . C o n s e q
31、u e n c e s o f r e d u c e d p r o d u c t i o n o f N O o n v a s c u l a r r e a c t i v i t y o f p o r c i n e c o r o n a r y a r t e r i e s a f t e r a n g i o p l a s t y : i m p o r t a n c e o f E D H F . B r J P h a r m a c o l , 2 0 0 2 ; 1 3 6,1 1 5 3 4 H a r n e k J , Z o u c a s E ,
32、S j u v e R, e t a l . L o c a l i n f u s i o n o f t h e n i t r i c o x i d e d o n o r S i n - 1 a f t e r a n g i o p l a s t y . E f f e c t s o n i n t i m a l h y p e r p l a s i a i n p o r c i n e c o r o n a r y a r t e r i e s . A c t s R a d i o l , 2 0 0 3 ; 4 4 ( 4 ): 3 9 5 5 V o n d
33、e r - T h u s e n J H, F e k k e s Ml , P a s s i e r R, e t a l . Ad e n o v i r a l t r a n s f e r o f e n d o t h e l i a l n i t r i c s y n t h a s e m ur m e a t t enuat e sl e s i o n f o r ma t i o n p o s t a n g i o p l a s t y m a o x i d e n o v e l r e s t enos i s. A r t e r i o s c l
34、 e r T h r o mb V a s e B i o l , 2 0 0 4 ; 2 4 ( 2 ): 3 5 7 6 R e d o n d o J , B i s h o p J E , Wi l k i n s MR . E f f e c t o f a t r i a l n a t r i u r e t i c p e p t i d e a n d c y c l i c G MP p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t i o n o n c o l l a g e n s y n t h e s i s b y
35、a d u l t c a r d i a c f i b r o b l a s t s . B r J P h a r m a c o l , 1 9 9 8 ; 1 2 4.1 4 5 5 7 C h u A J , P r a s a d J K . U p r e g u l a t i o n b y h u m a n r e c o m b i n a n t t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a - 1 o f c o l l a g e n p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d d e r m a l f i b r o b l a s t s i s m e d i a t e d b y t h e i n h i b i t i o n o f n i t r i c o x i d e s i g n a l i n g . J A m C o l l S u r g , 1 9 9 9 ; 1 8 8, 2 7 1 ( 收稿 : 2 0 0 5 - 0 9 - 2 8 )
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