新型人阳离子抗菌蛋白18的构建及其表达.pdf
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1、收稿日期 2005 -09 -16 基金项目 北京市自然科学基金资助 (5043029) 作者简介 王水明 (1970 - ) , 男, 四川省仁寿县人, 博士, 副 研究员。 新型人阳离子抗菌蛋白 18 的构建及其表达 王水明,彭瑞云,高亚兵,吴松峰,金 华,胡文化,贾永峰,王德文 (军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850) 摘要 目的: 构建新型人阳离子抗菌蛋白 18 (NHCAP18) 的氨基酸序列, 合成其编码基因并在原核细胞表达。方 法: 设计 NHCAP18 氨基酸序列, 经生物信息学分析后, 合成其编码基因, 将该基因插入表达载体 pGEX-4T-1, 尔后 在
2、大肠杆菌 BL21 中经 IPTG 诱导表达。结果: NHCAP18 经生物信息学分析符合改造要求, 构建的重组表达质粒 pGEX-4T-1/ NHCAP18 在大肠杆菌 BL21 中经 IPTG 诱导 4 h 表达量约占菌体总蛋白量的 39%, NHCAP18 经谷胱甘 肽-Sepharose 4B 亲合层析纯化后对大肠杆菌有杀灭作用。结论: NHCAP18 的成功改造, 重组蛋白 pGEX-4T-1/ HCAP18 在大肠杆菌 BL21 中高效表达及纯化, 为研究 NHCAP18 功能打下了良好的基础。 关键词 新型 HCAP18; 抗生素类; 生物信息学; 氨基酸序列; 基因表达; 大肠
3、杆菌 中图分类号 Q78; R978. 1文献标识码 A 文章编号 1000-5501 (2006) 02-0150-04 Construction and expression of new-type human cationic antimicrobial protein 18 WANG Shui-Ming,PENG Rui-Yun,GAO Ya-Bing,WU Song-Feng,JIN Hua,HU Wen-Hua, JIA Yong-Feng,WANG De-Wen (Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medic
4、al Sciences, Beijing 100850, China) Abstract Objective:To construct amino acid sequence of new-type human cationic antimicrobial protein 18 (NHCAP18) , whose genes were synthesized and expressed in prokaryocytes. Methods:NHCAP18 and its coding genes were devised and analyzed by bioinformatics. The g
5、enes were synthesized and inserted in expression vector pGEX-4T-1,re- construction expression plasmid pGEX-4T-1/ NHCAP18 was expressed in Escherichia coli BL21 with induction by IPTG. Results: Amino acid sequence of NHCAP18 accorded with that of reformation purpose,which was analyzed by bioinformat-
6、 ics,reconstruction expression plasmid pGEX-4T-1/ NHCAP18 was expressed in E. coli BL21 with an amount accounting for 39% of the total bacterial protein after induction by IPTG for 4 hours. NHCAP18 could kill E. coli after affinity chromatog- raphy and purification by glutathione sepharose 4B. Concl
7、usion:NHCAP18 is successfully reformed,reconstruction protein GEX-4T-1/ is efficiently expressed and purified in E. coli BL21 and NHCAP18 is purified, which establishes a satisfactory foundation for investigating NHCAP18 function. Key words new-type human cationic antimicrobial protein 18;antibiotic
8、s;bioinformatics; amino acid sequence; gene expression; Escherichia coli 近年来, 尽管各种抗生素的广泛应用、 临床监测技术及 治疗设备年复一年地改进, 生命支持疗法不断趋于完善, 然 而革兰阴性菌感染、 内毒素血症和脓毒症仍是烧伤、 创伤和 手术等患者常见的合并症, 由其引起的感染性休克和多器官 功能衰竭仍是当今住院患者死亡的主要原因之一 1。而抗 生素的广泛应用导致多重耐药菌株的大量出现及诱导内毒 素释放, 更加重病情的发展。因此, 针对临床感染, 尤其是耐 药菌感染及内毒素血症引发的防治难题, 探索新的防治对策 已成
9、为国内外瞩目的焦点和临床上亟待解决的前沿研究课 题。本研究通过氨基酸改造, 构建新型人源性阳离子抗菌蛋 白 18 (new-type human cationic antimicrobial protein 18 kDa, NHCAP18) , 经生物信息学分析后, 全序列合成 NHCAP18 编 码基因, 在大肠杆菌进行表达, 拟为最终获得具有广谱高效 抗菌及强大内毒素拮抗作用的 NHCAP18 奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 菌株和载体 大肠杆菌 DH5、 大肠杆菌 BL21、 表达载体 pGEX-4T-1 均购自上海博亚公司。 1. 2 工具酶和试剂 限制性内切酶 EcoR、 Sa
10、l、 T4 DNA 连接酶均为 Pro- mega 公司产品; 质粒 DNA 纯化试剂盒为 Sigma 公司产品; 谷 051 军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 Bull Acad Mil Med Sci,Apr 2006; Vol 30 No 2 胱甘肽-Sepharose 4B (glutathione sepharose 4B) 为 Pharmacia 公司产品; 凝血酶、 还原性谷胱甘肽及其他试剂购自上海生 物工程公司。 1. 3 表达载体构建、 分析和测序 NHCAP18 由 上 海 博 亚 公 司 合 成,将 NHCAP18 从 PMD18-T/
11、NHCAP18 质粒酶切、 电泳回收 NHCAP18, 插入表 达载体 pGEX-4T-1, 构建重组质粒 pGEX-4T-1/ NHCAP18, 转 化大肠杆菌 DH5, 克隆筛选、 质粒提取及电泳鉴定 2, 尔后 进行 DNA 序列测定, 测序工作由上海博亚公司完成。 1. 4 重组蛋白诱导及表达 将重组质粒 pGEX-4T-1/ NHCAP18 转化大肠杆菌 BL21, 经克隆筛选后, 菌株在含氨苄青霉素 (100 g/ ml) 的 LB 培 养基中 37振荡培养过夜, 次日按 1% 接种于新鲜培养基 中, 振荡培养至 D600=0. 5, 加入10 mmol/ L IPTG 至终浓度为
12、 0. 1 mmol/ L, 继续培养 4 h, 离心收集菌体, 用 SDS-PAGE (浓 缩胶 5%, 分离胶 15%) 分析确定融合蛋白表达。 1. 5 NHCAP18 蛋白纯化及抗菌活性初步评价 将经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX-4T-1/ NHCAP18/ BL21 重组菌用 PBS (pH 7. 2) 洗涤后重悬, 加入溶菌酶反复冻融 5 次, 再经超声波破碎至细菌完全溶解, 10 000 r/ min, 4 离心 30 min, 收集上清和包涵体沉淀。用 SDS-PAGE (浓缩胶 5%, 分离胶 15%) 分析确定融合蛋白表达位于包涵体后, 包 涵体经洗涤用裂解液溶解,
13、 离心后收集上清与谷胱甘肽- Sepharose 4B 充分混合, 离心后取上清, 再用 10 mmol/ L 还原 性谷胱甘肽溶液竞争性洗脱 NHCAP18 融合蛋白, 融合蛋白 经凝血酶 25作用 2 h, 加入谷胱甘肽-Sepharose 4B 第 2 次 层析, 收集未被吸附的样品即为纯化的 NHCAP18 蛋白。将 纯化的 NHCAP18 蛋白与大肠杆菌 DH5 混合后, 涂布于无 氨苄青霉素琼脂培养板, 观察细菌生长, 初步评价其杀菌作 用。 2 结 果 2. 1 NHCAP18 的构建及生物信息学分析 本实验对原有 HCAP18106-137氨基酸构成加以改造, 将 109 As
14、p 置换为 Asn; 116 Glu 置换为 Gln; 121 Glu 和 130 Lys 置换为 Leu; 127Gln、 131Asp 和 135Asn 置换为 Lys, 通过增加 疏水性和阳离子性而不改变其 -螺旋结构, 以最大限度地 增强其生物学活性, 构建 NHCAP18, 其序列为 NH2-LLGNF- FRKSKQKIGKLFKRIVKRILKFLRKLV-CONH2。 应用 生 物 信 息 学 方 法 和 技 术 对 HCAP18106-137和 NHCAP18106-137基本性质、 二级结构、 抗菌和内毒素拮抗功能 等进行了系统性的分析和比较,NHCAP18106-137肽
15、 pI 值变 大、 疏水性变大、 正电性升高, 相对分子质量、 半衰期基本相 同 (表 1) , 二级结构没有受到影响仍为 -螺旋结构, 原有 - 螺旋结构, 一面是疏水, 一面是亲水, 完全保守的氨基酸在亲 水和疏水两面中几乎是一样多 (图 1) ; 而改造的氨基酸几乎 都在亲水侧面 (图 2) 。理论上抗菌和内毒素中和作用增强。 表 1 HCAP18106-137和 NHCAP18106-137基本性质比较 参数等电点相对分子质量阴性残基阳性残基 半衰期 (t/ h) (网织红细胞) 疏水性 HCAP1810.623 922.72(Asp + Glu) : 4(Arg + Lys) : 1
16、05. 5-0. 491 NHCAP1812.493 916.98(Asp + Glu) : 0(Arg + Lys) : 125. 5-0. 059 图 1 改造前 HCAP18 (绿色为保守氨基酸) 图 2 改造后 HCAP18 (黄色为改造氨基酸) 151 第 2 期 王水明, 等 . 新型人阳离子抗菌蛋白 18 的构建及其表达 2. 2 NHCAP18 编码基因的设计、 合成与鉴定 在设计合成由 32 个氨基酸组成的 NHCAP18 编码基因 时, 根据氨基酸序列, 选用大肠杆菌偏爱密码子, 清除序列中 的多重互补区, 减少富含 AT、 GC 区域, 为便于克隆与表达, 在片段的 5端
17、添加了起始密码子 ATG 和 EcoR酶切位点, 在片段的 3端添加了终止密码子 TAATAG 和 Hind酶切位 点, 序 列 为 5-GAATTCATGCTGCTGGGTAATTTTTTTCGTAAA- TCTAAACAGAAAATCGTAAACTGTTTAAACGTATCGTTAAACG- TATCCTGAAATTTCTGCGTAAACTGGTTTGAGTCGAC-3, 将 pMD18-T/ NHCAP18 用 EcoR、 Sal双酶切回收目的基因片 段, 插入表达载体 pGEX-4T-1 的多克隆位点, 转化大肠杆菌 DH5, 随机挑选克隆鉴定 pGEX-4T-1/ NHCAP18,
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- 新型 阳离子 抗菌 蛋白 18 构建 及其 表达
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