小鼠CDK4基因RNAI慢病毒载体的构建及体外研究.pdf
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1、神经损伤与功能重建2 0 0 8 年1 1 月第3 卷第6 期 【D o l 】1 0 3 8 7 0 s j s s c j 2 0 0 8 0 6 0 0 1 3 7 l 论著 小鼠C D K 4 基因R N A i 慢病毒载体的构建及体外研究* 降风1 2 ,王雪贞1 ,卜碧涛1 ,张苏明1 ,张曼1 # 1 华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉4 3 0 0 3 0 ;2 内蒙古自治区医院神经 内科,呼和浩特0 1 0 0 1 7 【摘要】 目的:探讨C D K 4 在神经系统变性疾病中的作用,并构建携带小鼠C D K 4 一s i R N A 的慢病毒载体进行 体外研究。
2、方法:设计3 个C D K 4 一s i R N A 序列和1 个无关对照序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的 p S I H l 一H 1 c o p G F Ps i R N A 载体。重组质粒经P C R 和测序鉴定后,脂质体介导下转染B v 2 细胞,w e s t e r nb l o t 检 测c D K 4 的表达,筛选出干扰效果最佳的p S I H l s i R N A 2 。将对照序列和p S I H s i R N A 2 分别与慢病毒包装质粒共 转染2 9 3 T 细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。结果:慢病毒感染B v 2 细胞后可表达G F P ,R
3、 T - P C R 和W e s t e mb l o t 检测C D K 4 的表达明显下降。结论:成功构建携带C D K 4 一s i R N A 的慢病毒载体,体外研究显示其 能明显下调C D K 4 的表达。 【关键词】C D K 4 ;神经系统变性疾病l R N A 干扰;慢病毒载体 【中图分类号】R 7 4 1 ;R 7 4 1 0 2 【文献标识码】A 【文章编号】1 0 0 1 1 1 7 X ( 2 0 0 8 ) 0 6 一0 3 7 1 一0 3 C 哪t m c “o na n dI d e n “n c a t i o no fL e n t i v e c t o
4、 r _ m e d i a t e dC D K 4 一R N A i ,M N GF 已打g ,W A N GX “P z e 咒,B UB f 一 口o ,Z H A N GS 群一研i n g Z H A N GM i ”D P 户口r t 舢九fD ,N P M r D f D g y ,丁b 以酊iH D 5 户i f 口f ,丁b 竹酊iM 以i f n ZC o Z Z P g P , H 如抽D 咒g i 御戚砂D ,S c i 鲫c P 彻dn f 咒o Z D g y ,W u h a n4 3 0 0 3 0 ,C h i n a 【A h t m c t 】0 b j
5、 e c t i v e :T os t u d yt h er o l eo fC D K 4i np a t h o g e n e s i so fn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e A n dt oc o n s t r u c tl e n t i v e c t o rc a r f y i n gm u r i n eC D K 4 一i n t e f f e r e n c eR N A ( R NA i ) f o rs t u d y 翻卫i f r 0 M e t h o d s :T h r e ep a i
6、r so fm u r i n eC D K 4 一s i R N Aa n donep a i ro fn e g a t i v ec o n t r o ls e q u e n c ew e r ed e s i g n e d ,t h e nc l o n e di n t op S I H 卜H 1 一c o p G F Ps i R N Av e c t o r T h ea b o v er e c o m b i n a n t sw e r et r a n s f e c t e di n t oB 1 V - 2c e l l sm e d i a t e db yl
7、 i p o f e c t a m i n e T h eg e n es i l e n c i r l g e f f i c a c yo f3t a r g e t sw a sc o m p a r e db yw e s t e r n b l o ta r 比l y s i s T h eo p t i m i z e dp S I H l 一s i R N A 2a n dp S I H n e g a t i v ew e r e c o t r a n s f e c t e di n t o2 9 3 Tc e l l s T h em o s te f f e c t
8、 i v e ( p S I H s i R N A 2 ) w a ss c r e e n e do u tb yw e s t e r nb l o t P S I H n e g a t i v e 、p S IH s i R N A 2a n dl e n t i v i r a lp a c k a g i n gp l a s m i dw e r ec o t r a n s f e c t e di n t op a c k g i n gc e l ll i n e2 9 3 T C u l t u r es u p e r 柏t a n t sw e r eh a r v
9、 e s t e da n dc o n d e n s e dt og e n e r a t et h el e n t i v i r u se n c o d i n gC D K 4 一R N A j R e s u l t s :G F Pe x p r e s s i o n c o u I db ed e t e c t e di nB 、L 27 2ha f t e ri n f e c t i o no ft h er e c o m b i n a n tl e n t i v i u r s A n dt h ee x D r e s s i o no fC D K 4
10、d e c r e a s e d o b v i u s l yd e t e c t e db yR T P C Ra n dW e s t e r nb l o t t i n g C o n c l u s i o n :L e n t i v e c t o rc a r r y i n gC D K 4 一s i R N Ai sa b l et od o w n r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fC D K 4g e n ei 咒口i f ,0s i g n i f c a n t l y 【K e yw o 兀k 】C D K
11、4 ,n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e - R N Ai n t e r f e r e n c e ;l e n t i v i r a Iv e c t o r 细胞周期依赖性蛋白激酶( c y c l i nd e p e n d e n t k i n a s e s ,C D K s ) 活性失调和细胞骨架蛋白过度磷酸 化是包括阿尔茨海默病( A D ) 、肌萎缩侧索硬化症 ( A L S ) 和C 型N i e m a n n P i c k 病( N P C ) 在内的一系 列神经系统变性疾病的特征性病理表现叭川。有学
12、说认为这些改变最终导致标志性细胞骨架损害,如 神经原纤维缠结和轴突球状体的形成,许多研究证 实C D K 4 起关键作用口 。R N A 干扰( R N A i n t e r f e 卜 【基金项目】国家自然科学基金( N o 3 0 4 0 0 1 4 N o 3 0 6 7 0 7 3 7 ) 【收稿日期】2 0 0 8 一0 5 2 2 q 通讯作者】张曼T e l :8 6 2 7 - 8 3 6 6 2 4 1 8 ,E m a i l = m 曲a n g t j h t j m u e d u c n 。 e n c e ,R N A i ) 技术是一种小片段双链R N A 介
13、导的 特异性基因沉默技术 4 ,在哺乳动物细胞内,R N A i 可被携带s i R N A 的病毒载体触发,永久性沉默靶基 因 5 。慢病毒( 1 e n t i v i r u s ) 系统可将目的基因有效输 入到细胞核,高效整合并稳定表达,可感染分裂和非 分裂细胞,是神经系统基因治疗中R N A i 的较好工 具 6 。本研究构建携带小鼠C D K 4 一小分子干扰 R N A ( s m a l li n t e r f e r i n gR N A ,s i R N A ) 的慢病毒载 体并在体外检测它沉默C D K 4 的效果。 l 资料与方法 1 1材料 p S I H l 一H
14、 1 一c o p G F P 质粒、p P A C K H l 万方数据 3 7 2 N e u 阳ll n j u r ya n dF u n c t i o n a lR e c o n s t r u c t i o n ,! ! 竺。m 6 1 11 1 1 111 11 :! N o 6 慢病毒包装系统( 购于美国S B I 公司) ,B V 一2 细胞系 ( 由本实验室提供) ,质粒提取和胶回收试剂盒( 购于 德国Q i a g e n 公司) ,限制性内切酶、T a qD N A 聚合 酶、T 4D N A 连接酶( 购于美国N E B 公司) ,胎牛血 清和高糖D M E M
15、 ( 购于美国G i b c o 公司) ,脂质体 2 0 0 0 ( 购于美国I n v i t r o g e n 公司) ,蛋白酶抑制剂 c o c k t a i l ( 购于美国S i g m a 公司) ,兔抗C D K 4 ( 购于 美国S a n t aC r u z 公司) ,D N A 合成( 购于上海生工 公司) 。 1 2方法 1 2 1P S l H S i R N A 载体的构建根据基因库的 小鼠C D K 4 基因序列,用在线s i R N A 设计软件设计 3 条C D K 4 一s i R N A 和1 条阴性对照序列,即s i R N A1 :F G A T
16、 C C G T G T G A G A G T T C C T AA T G G T T C A A G A G A C C A T T A G G A A C T C T C A C A C T T T T T G ;s i R N A 2 :F G A T C C T T G T A C G G C T G A T G G A T G T T T C A A G A G A A C A T C C A T C A G C C G T A C A A T T T T T G ;s i R N A 3 :F G A T C C C A G A G A A C A T T C T A G T
17、G A C T T C A A G A G A G T C A C T A G A A T G T T C T C T G T T T T T G ;对照序列:F G A T C C T T C T C C G A A C G T G T C A C G T C T T C C T G T C A G A A C G T G A C A C G T T G G A G A A T T T T T G 。设计 好的s i R N A 的正义链和反义链化学合成后退火,通 过T 4D N A 连接酶插入到经B a m H l 和E c o R I 酶切 后的线性质粒p S I H l 一H 1 一c
18、 o p G F P 中,连接产物转 化感受态细胞D H 5 Q ,青霉素抗性的I 。B 培养基培 养,提取单克隆质粒后通过P C R 和测序鉴定。P C R 引物:F A A T G T C T T T G G A T T T G G G A A T C T T A , R T G G T C T A A C C A G A G A G A C C C A G T A 1 2 2 细胞培养和质粒转染B V 一2 细胞用1 0 高糖型D M E M 培养基于3 7 、5 C ( ) 2 培养箱中培 养。转染前2 4h ,接种细胞于6 孔板,脂质体2 0 0 0 介导4 个重组质粒转染B V 一
19、2 细胞,按说明书操作。 1 2 3W e s t e r nb l o t 分析 W e s t e r nb l o t 检测3 个C D K 4 一s i R N A ( p S I H 卜s i R N A l 、p S I H l 一s i R N A 2 、 p S I H l 一s i R N A 3 组) 、1 个对照s i R N A 序列( 对照组) 和空白细胞( 空白组) C D K 4 基因沉默效果。转染 4 8h 后,收集3 组细胞,常规裂解,提取蛋白,Q u b i t 蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。上样量4 0 ”g , 1 2 的聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后进行免疫
20、印记, 加入一抗C D K 41 ;4 0 0 ,B a c t i n1 :5 0 0 ,4 孵育过 夜。辣根过氧化物酶标记的二抗1 :1 0 0 0 孵育后用 增强化学发光( E C L ) 法曝光、显像,再经N I HI m a g e S o f t w a r e 扫描胶片上的条带,并测定灰度值。 1 2 4 病毒生产和浓缩将沉默C D K 4 基因效果 最佳的p S l H l 一s i R N A 2 组和对照组分别与慢病毒 包装质粒瞬时共转染2 9 3 T 细胞。在2 4h 和4 8h 收 集病毒上清并浓缩,观察G F P 表达,采用系列稀释 法测定病毒滴度,慢病毒一8 0 保
21、存。 1 2 5 病毒感染细胞和体外功能鉴定 感染前 ld ,接种B V 一2 细胞到6 孔板,接种量约为5 1 0 6 细胞孔,完全吹散。慢病毒感染时。细胞汇合程度 约3 0 。每孔加2 0 “I 。病毒液,荧光显微镜观察 G F P 表达,感染7 2h 后收获细胞并通过R T P C R 和W e s t e r nb l o t 检测其沉默效率。 1 3 统计学处理采用S P S S l l o 统计软件分析 数据,f 检验,P O 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1重组质粒鉴定重组质粒和空载体的P C R 鉴 定结果和预期结果一致,见图1 。测序证实,3 个 C D K 4
22、 一s i R N A s 和阴性对照s i R N A 准确插入 p S I H 卜H l - c o p G F P 质粒。 图1重组质粒的P C R 鉴定电泳结果A 为空载体 ( 2 1 7b p ) ,B 为阳性对照载体。c 为对照组( 2 7 8b p ) ,D 为 p S l H l 一s i R N A l 组( 2 7 8b p ) ,E 为:p S I H l 一s i R N A 2 组 ( 2 7 8b p ) ,F 为p S I H 卜s j R N A 3 组( 2 7 8b p ) ,G 为m a r k e r 2 2 p S I H s i R N A 介导C
23、D K 4 基因沉默 W e s t e r n b l o t 检测下调C D K 4 表达的效果显示,与空白组相 比,p S I H s i R N A 2 组C D K 4 表达下降明显,其它均 无明显下调,见图2 ,提示p S I H s i R N A 2 沉默 C D K 4 效果最佳。各组p a c t i n 无明显差异。 图2w e s t e r nb l o t 检测重组质粒沉默c D K 4 效果 A 为 p S I H 卜s i R N A l 组。B 为p s I H s i R N A 2 组,C 为p s I H l - s i R N A 3 组,D 为对照组
24、。E 为空白组 2 3 病毒生成和浓度测定s i R N A 表达质粒和病 毒包装质粒共转染2 9 3 T 细胞后,2 4h 可见绿色荧光 万方数据 神经损伤与功能重建2 0 0 8 年1 1 月第3 卷第6 期 蛋白表达,测定携带C D K 4 一s i R N A 的慢病毒和对照病 毒浓度分别为2 1 0 8i f u m L 和1 1 0 8i f u m L 。 2 4R T P c R 和w e s t e r nb l o t 分析 慢病毒感染 B V 一2 细胞7 2h 后R T P C R 和W e s t e r nb l o t 显示, 对照组转染效率为5 0 ,与空白组比
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- 小鼠 CDK4 基因 RNAI 病毒 载体 构建 体外 研究
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