小鼠急性缺血-再灌注肾损伤模型的建立及体会.pdf
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1、岭南现代临床外科2005年12月第5卷第4期Lingnan Modern Clinics in Surgery,Dec. 2005,Vol.5 No.4 缺血性急性肾衰竭(acute renal failure ARF )是 常见临床综合征,致死率较高,近年来,由于体外循 环等高难度手术的开展, 缺血性ARF的发病率有 明显升高趋势1,2。 目前认为缺血-再灌注损伤是缺 血性ARF的主要发病机制。 由于ARF本病常呈散 发分布于临床各科,而且病情凶险,抢救过程中各 种治疗干预极其复杂,使得很多临床研究不能在病 人身上开展。因此,动物实验是开展急性缺血-再灌 注肾损伤研究的常用方法。 在动物实验
2、中,合格的 动物模型建立是实验研究成功的基础和关键。 狗、 兔等均用于本模型建立3,但以大鼠最常用4。但对收稿日期:2005 04 26 小鼠急性缺血-再灌注肾损伤模型的建立及体会 李广宇 1 周南 2 王利民 2 黄有林 1 吴陈喾 1 刘华锋 2 南海石油公司职工医院外科 1 (湛江524057) 广东医学院肾病研究所 2 (湛江5240001) !摘要“目的观察应用小鼠制备急性缺血-再灌注性肾损伤模型的效果。 方法应用微型动脉夹夹闭小鼠双 侧肾动脉制备急性缺血-再灌注肾损伤模型, 其中两组分别于术后24h和48h后处死观察肾功能及肾脏病理变化, 另一组观察其病情及存活情况14天。 结果各
3、次造模成功率均达85%以上;术后24h及48h实验组血清肌酐(Scr) 和血尿素氮(BUN)水平明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(PK0.01);实验组肾脏外观出现典型“大白肾“表 现,镜下出现典型急性肾小管坏死表现,并有较多炎症细胞浸润,肾小管组织学评分与对照组比较差异有统计学意 义( P均K0.01);实验组在观察期间逐渐出现典型急肾衰竭表现,至14天末,死亡率达L1.7%,而对照组全部正常存 活。 结论应用微型动脉夹夹闭小鼠双侧肾动脉可制备稳定急性缺血-再灌注肾损伤模型,而且成功率较高。 !关键词“急性肾衰竭急性缺血-再灌注损伤动物模型 中图分类号#R 332 文献标识码#A 文章
4、编号#100L-L76M$2005%04-0308-04 Model cons ruc ion of renal acu e ischemia3re4erfusion in5ur6 in mice LI uang_yu,ZHOU Nan,WAN Li_ming,HUAN You_lin,WU Chen_ku,LIU Hua_feng. Department of Surgery,Staff Hospital of South China sea petrolic company,Zhanjiang,Nuangdong 524O57 .78s rac /985ec i:ePo construct
5、 the Qodel of renal acute ischeQia reRerfusion inSury in Qice and oTserUe the result of the Qodel.;e hoonclusion StaTle Qodel of renal acute ischeQia reRerfusion inSury of Qice can Te RreRared Ty aRRlying Qicro artery claQR to incarcerate Tilateral Qices renal arteries. And its successful rate is Ue
6、ry high. .?e6 ords/Acute renal failure;Acute ischeQia reRerfusion inSury;AniQal Qodel 308 岭南现代临床外科2005年12月第5卷第4期Lingnan Modern Clinics in Surgery,Dec. 2005,Vol.5 No.4 组别 对照组(%) 实验组(%) 24h实验组 100(13/13) 87(13/15)! 48h实验组 87(13/15) 87(13/15)! 生存率观察组 100(12/12) 86(12/14)! 于一些药物作用的研究, 大型动物药物消耗量大, 如果拟使用的
7、实验药品价格昂贵,小型动物如小白 鼠便是理想的造模工具。 另一方面,由于小白鼠较 为娇嫩,肾脏及肾动脉小且难于寻找,造模难度大, 容易增加实验误差。本研究我们应用微型动脉夹夹 闭小鼠双侧肾蒂方法制备急性缺血-再灌注肾损伤 模型,取得较为满意的造模效果,现将结果作一报 道。 材料与方法 1.实验动物:2025g雄性昆明小鼠(清洁级) 由广东医学院实验动物中心提供;微型动脉夹由湛 江科迪士公司提供; 麻醉用戊巴比妥钠购自美国 Sigma公司。 2.造模方法 (1)动物分组:本研究分为三个组,即24h组、 48h组和14天病情及生存率观测组。24h 组: 28只 小鼠经随机分组,其中对照组13只,实
8、验组15 只; 48h组:30只小鼠经随机分组, 其中对照组15只、 实验组15只; 病情及生存率观测组:26只小鼠随 机分组,对照组12只、实验组14 只。 (2)手术过程:常规消毒手术器械、准备无菌手 术台,0.3%的戊巴比妥钠配制后抽滤灭菌,0.3%戊 巴比妥钠腹腔注射麻醉成功后, 备皮消毒手术野。 (1)实验组:沿腹正中纵轴线做0.81cm的切口,找 到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左右肾蒂, 肾脏由红变紫黑色表示夹闭成功, 共持续夹闭 45min。 分层缝合关闭腹腔。 术后小鼠于2429的 环境,密切观察小鼠的生命体征,同时补充水与饲 料。 (2)对照组:同法打开腹腔并找到肾蒂,但
9、不夹 闭肾蒂。 (3) 模型成功判定:松开动脉夹观察肾脏从紫 黑色转红色说明经过肾脏缺血-再灌注病理生理过 程;参考Vyacheslav等5和张萱等6的方法,如果松 开动脉夹后5min,肾脏未转变为正常的红色,则认 为再灌注未成功;术中如损伤大血管或者周围组织 时认为造模不成功; 关腹观察继续观察2小时,如 动物能正常活动说明造模成功,也认为造模不成功 剔除。 3.实验指标检测 (1) 标本收集:24h组、48h组分别在术后第 24h和48h处死,处死后立即眼球放血,继之迅速 分离小鼠的左右肾脏,记录双肾肉眼外观,然后每 侧肾各取1块组织置于10%的中性甲醛中4固 定过夜。 所得血液常规分离血
10、清并置-70液超低 温冰箱中待检。 (2)肾功能检测:血清肌酐(Scr)和血尿素氮 (BUN)采用美国Backman全自动生化检测仪检测。 (3) 肾脏病理检查: 已固定肾组织经脱水、透 明、 浸蜡和包埋等步骤制成蜡块后制作厚度2m 切片,染色前切片常规脱蜡入水,最后行HE染色 和PASM染色。 肾脏病理变化评价参照Pallers标 准7在400倍光镜下随机选取5个视野,每个视野 选10肾小管进行评分,其中皮质髓质各半。 (1 )肾 小管明显扩张,细胞扁平为1分;(2)刷状缘损伤为 1分,脱落为2分;(3)细胞膜大泡1分,细胞浆空 泡1分;(4)间质水肿1分;(5)肾小管腔内有脱落 的坏死细胞
11、未形成管型或碎片为1分,形成管型或 碎片为2分。 肾小管评分由两名技术员双盲计算, 取其平均值。 (4) 生存率观测:病情及生存率观测组组于造 模成功后不处死动物,每天定时观察和记录实验动 物表现2次,至术后满14天停止,分别记录动物的 病情和死亡时间。 4.统计学处理: 使用SPSS11.0统计软件进行 统计分析,计量资料组间差异采用t检验,计数资 料组间差异采用“2检验, 组间累计生存率的比较 采用Kaplan-Meier分析。 结果 1.手术成功率:不同时间三次造模成功率如下 表,可见各次造模的成功率均大于85%,实验组的 成功率与对照组比较差异并无显著性。 2.术后肾功能变化:对照组和
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