小鼠骨性关节炎的模型制备及评价.pdf
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1、第1 8 卷第8 期 2 0 0 8 年4 月 中国现代医学杂志 C h i n aJ o u m a lo fM o d e mM e d i c i n e V 0 1 1 8N o 8 A p r 2 0 0 8 文章编号:1 0 0 5 8 9 8 2 ( 2 0 0 8 ) 0 8 1 0 4 5 一0 3 小鼠骨性关节炎的模型制备及评价术 刘安军,陈宏硕,刘颖芬,王维君,孟艳丽,张国蓉 ( 天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津3 0 0 4 5 7 ) 论著 摘要:目的探讨骨性关节炎的小鼠动物模型制备及评价方法。方法将昆明小鼠随机分为两组:即正常组和 模型组。模型组采取4 冷水
2、冷冻刺激小鼠膝关节制作骨性关节炎模型。在造模1 5 d 和3 0 d 时分别对小鼠膝 关节肿胀度进行关节炎指数( A I ) 评定;并取小鼠膝关节软骨作H E 染色j 用双抗体夹心一E L l s A 法检测大鼠血 清中肿瘤坏死因子一d 口NF 一值) 、透明质酸( H A ) 水平。结果与正常组小鼠相比,3 0d 时模型组小鼠A I 值高 达3 8 ;H E 染色显示模型组小鼠出现典型的骨性关节炎病变症状;模型组血清中T N F d 、透明质酸含量有显 著升高。结论小鼠冷冻造模能为研究骨性关节炎的发病机制提供理想的实验动物模型。 关键词:骨性关节炎;肿瘤坏死因子一仪;透明质酸 中图分类号:R
3、 一3 3 2文献标识码:A ”11J pJJ J 1 E S t a D J j S n m e n ta n de V a l U a t l O n0 10 S t e o a r t n n t l Sm o d e ll nm l C e U UA n j u n ,C H E NH o n g s h u o ,U UY i n g f e n ,W A N GW e i _ j u n ,M E N GY a n _ l i ,Z H A N GG u o r o n g ( 脚删脱n 矿而o dE n 画聊P r i 昭& 日幻把c n o 地弘孔。巧抚C 厩劾e 船渺矿S c
4、 据肿e & 7 0 c 五凡。幻朗死嘶讥3 D D 钙乃P 尺C 危i ,m ) A b s t r a c t :【o b j e c 廿v e 】T od i s c u 8 st l l e 地t I l o do fm i c eo s t e o a 曲r i t i sn l o d e lp r e p a r a t i o na 1 1 de v a l u a t i o n 【M e t h o d s 】 K u n m i n g m i c ew e r er a n d o m 【yd i v i d e di n t ot w og r o u p s :n
5、o n n a lg r o u pa n dm o d e lg r o u p K J l e ej o i n t so fm o d e l g r o u pw e r ef b e z e d 诵m4 c o l dw a t e rt os e tu po s t e o a n h r i t i sm o d e l 15d a y sa n d3 0d a y sl a t e r a n h r i t i si n d e xw 鹊 e v a l u a t e dt 0d e t e 册i n et l l ed e g r e eo fa 甜l r o c e l
6、 e ;m i c ek n e ea n i c u l a rc 砌a g ew a sm a d ei n t os l i d e sa n ds t a i n e dw i t I l H & E ;也el e v e l so fT N F 0 ca n dH Aw e r ea s s a y e db yd u a la n t i b ( ) d yE u s A 【R e s u l t s 】c o m p a r e d 试t ln o 册a l 铲o u p , t l l eA Jo f m o 1 e lg r o u pr e a c h e da sh 讪a
7、 83 8o nm e3 0 t l ld a y H Es 协i n i n go f t l l em o d e lg r o u ps h o w e dt ) r p i c a l p a t h o l o 百c a lc h a n g e so fo s t e o a n I l r i t i s ;T h el e v e l so fT N F - 也粕dH Ac o n c e n 妇t i o n 8i n c r e a s e ds i 印i f i c a J l d y 【c o n c l u _ s i o n 】 ,1 1 l en l i c eo
8、 s t e o a 砒d t i sm 0 ( I e lp r e p a r e db y “e z m gm e 也1 ) di sa J li d e a l 柚i m a lm o d e lt o8 t u d yp a t h o g e n e s i 8o f o s t e o a r t h I i t i s 。 K e yw o r d s :o s t e o a n h r i t i s ;t u m o rn e c r o s i sf a c t o 卜a ;h y a l u m n i ca c i d 骨性关节炎( o s t e o a r 【t
9、 i s ,O A ) 是一种由多种原 因所致的慢陛退行性关节病变,以关节软骨变性、破 坏及骨质增生为主要特征。目前,O A 造模方法卧5 l 主 要有:通过人工筛选或基因改造获得自发性O A 动 物模型;通过关节固定、人工造成关节不稳定或关节 腔注射化学药物致软骨降解变性物质等方法诱导关 节退行性变。因此,骨性关节炎动物模型的建立是 研究O A 发病机制、治疗及预防的必要手段,一般采 用兔子或大鼠建模,尚未见到以小鼠建模的报道。 本文采取冷冻刺激小鼠膝关节来制作骨| 生关节炎模 型,并建立模型评价的方法,目的就是要尽最大程度 模仿人类O A 的病理生理过程,从而为深入研究O A 发病机制和评
10、价药物疗效提供一个实用而可靠的动 物模型,现报道如下: 1 资料与方法 1 1 材料 实验动物:雄性清洁级昆明小鼠4 0 只,平均体 重2 0g 左右,由中国人民解放军军事医学科学院实 验动物中心提供。主要试剂:肿瘤坏死因子酶联免 收稿日期:2 0 0 7 0 9 2 7 陋讯作者】张国蓉,女,教授,研究方向:细胞及实验动物学。 - 1 0 4 5 万方数据 中国现代医学杂志 第1 8 卷 疫吸附法( E U S A ) 试剂盒删F 一仪,上海森雄科技 实业有限公司产品) 、透明质酸E L I s A 试剂盒( H A , 上海森雄科技实业有限公司产品) 。主要仪器:酶 标仪( r r h e
11、 瑚oE l e c 仃o nu S A ) 、光电显微镜( 上海复日 科技有限公司) 。 1 2 模型制备 动物适应性饲养7d 后,随机分为2 组:第一组 2 0 只不做任何处理,为正常对照组;第二组2 0 只为 模型组,每天早晚用4 冷水冷冻刺激小鼠右腿膝 关节处各2h 。 1 3 关节炎的判断标准 关节炎指数旧( a I t h r i t i si n d e x ,A I ) 评定采用关节 炎评分法( 0 4 级) 。O 分:无关节炎;1 分:关节有红 色斑点或轻度肿胀;2 分:关节中度红肿;3 分:关节 重度红肿;4 分:关节严重红肿且不能负重。 1 4 血清肿瘤坏死因子一o c
12、( t u m o rn e c r o s i s f a c t o 卜a ,T N F o c 】、透明质酸( h y a I u r o n i ca c d , H A ) 的测定 在4 冷水刺激小鼠膝关节1 5d 和3 0d 后,正 常组和模型组分别随即取出1 0 只小鼠眼球取血,静 置3 0m i n ,25 0 0r ,m i n 离心1 0m i n 以分离血清,一 2 0 保存。酶联免疫吸附法( E u S A ) 法检测血清中 T N F 一晓、透明质酸含量。 1 5 小鼠膝关节软骨切片制作及H E 染色 根据文献报道”,本实验分别取正常组与模型 组小鼠膝关节新鲜软骨组织
13、,波恩液固定7 2h ,依地 酸脱钙1 个月,常规脱水,石蜡包埋,连续切片( 厚 4 “m ) 。采用常规H E 染色观察软骨组织病理改变。 1 6 统计学处理 所得数据用均数标准差( 互s ) 表示,统计学 分析采用双样本等方差假设的t 检验法,以P 0 0 5 为差异有显著性。 2 结果 2 1 动物观察 图1 正常组( 4 0 0 ) 冷冻刺激小鼠l o d 后,模型组有1 8 只动物膝 关节处出现中度红肿,其余2 只轻度红肿;1 5d 后红 肿均加重;3 0d 时模型组小鼠关节肿胀度达高峰,并 相继出现体重下降、轻度脱毛及食欲下降等关节外 症状,但无小鼠死亡情况。正常对照组则无任何异
14、常变化。 2 2 关节炎指数( A I ) 评定结果 模型组小鼠在冷冻刺激1 5 后出现明显肿胀情 况,其A I 值达到了3 0 ;3 0d 时红肿最为严重,其A I 值达到了3 8 ;3 0d 后模型组小鼠关节红肿均无明显 变化,见表l 。 表1 关节炎指数( A | ) 评定结果6 s ) 注:t 与空白组相比,P 0 0 1 2 3 血清中T N F a 、透明质酸( H A ) 含量水平测 定结果 冷冻刺激小鼠膝关节1 5 和3 0d 后,正常组和 模型组分别随即取出l O 只小鼠眼球取血,分离血 清,E L I S A 法检测血清中T N F 一仅、透明质酸含量。如 表2 、3 所示
15、,在冷冻刺激1 5d 时模型组小鼠血清 T N F 一仪含量与正常组相比极显著升高( P 0 0 1 ) ; , 表2 小鼠血清中T N F _ o c 含量测定结果( 舭,;s ) 注:1 ) 与空白组相比,P 0 0 5 ; 2 ) 与空白组相比,P ( o O l 表3 小鼠血清中H A 含量测定结果( n 咖L ,互s ) 注:1 ) 与空白组相比。P o 0 5 ; 2 ) 与空白组相比,P o 0 l 图2 模型组1 5 d ( 4 0 0 )图3 模型组3 0 d ( 4 0 0 ) 1 0 4 6 万方数据 第8 期刘安军。等:,:I 、鼠骨性关节炎的模型制备及评价 模型组小鼠
16、血清H A 含量与正常组相比显著升高 ( P 0 0 5 ) 。在冷冻刺激3 0d 后,模型组小鼠血清 F 一0 【含量、H A 含量与正常组相比极显著升高( P 0 0 1 ) 。 2 4 H E 染色 正常对照组( 见图1 ) 膝关节软骨染色均匀,细 胞排列规则有序,呈梭形,并且细胞无簇集现象,无 细胞分布密度的减少,未见软骨退化现象,具有典型 的关节透明软骨结构。而模型组( 见图2 、3 ) 关节软 骨受到寒冷刺激之后细胞排列紊乱,细胞簇集明显, 可见有细胞核缩、核溶、细胞消失现象,基质染色不 均、淡染。 3 讨论 近年来,关于骨性关节炎模型的制作大都集中 在兔子、大鼠等个体大的实验动物
17、身上,造模方式主 要就是机械损伤和注射化学物质造模,其缺点是造 模时间长、技术性要求高。本文采用小鼠通过冷冻 刺激实验制作骨性关节炎模型,以期建立更为简便 实用的关节炎模型。 关于骨性关节炎的评价指标也有很多,主要集 中在组织H E 染色观察细胞形态变化、体内白细胞 介素一l 、T N F 一仪、透明质酸( H A ) 等重要指标含量 变化方面。其中,T N F _ 仪是机体炎症反应与免疫应 答的重要调节因子,T N F o 【既能刺激I L 一1 、I L - 6 、 I L _ 8 的产生,又能刺激其自身的合成,在O A 的细胞 因子网络中起中心作用。因此,T N F 一仪是参与O A 发
18、病过程重要的细胞因子,它与O A 滑膜炎性病变、 关节软骨基质降解及干扰软骨细胞功能密切相关。 此外,透明质酸( H A ) 也是一重要指标。因为它是构成 关节软骨和滑液的主要成分,当发生骨性关节炎关 节疾病时,H A 在关节内的产生和代谢发生异常,滑 液中H A 的浓度和相对分子质量明显降低,软骨发 生降解和破坏,导致关节生理功能障碍。关节滑液 中H A 主要通过附近的淋巴管道进入外周血液循 环,关节内H A 生成增多,进入血液循环H A 量增 加,从而可引起血清H A 量增加。骨关节炎病变明 显者,更可能诱发较重的滑膜炎,H A 则更易通过病 变组织进入淋巴管道人血液循环。有研究表明【m
19、峋, 血清H A 水平升高与关节滑液中H A 水平降低有相 关性。因此,测定血清中T N F 一仪、透明质酸( H A ) 的 含量变化对于评价O A 具有重要意义。 本文首先通过动物观察及关节炎指数的评估以 确定小鼠骨性关节炎模型的建立,然后对T N F 一仅、 透明质酸( H A ) 的含量进行了测定,并应用H E 染 色观察关节软骨损伤特征。结果表明,模型组小鼠 血清T N F _ 仪含量、H A 含量与正常组相比均有显著 升高。H E 染色也可见模型组小鼠出现骨性关节炎 病理特征。以上结果均与骨性关节炎患者特征非常 相似,由此可见小鼠的冷冻造模成功。 综上所述,以小鼠通过冷冻刺激实验制
20、作骨性 关节炎模型具有造模简单、时间短等优点,从而为人 类骨性关节炎的病理研究以及药物筛选提供了另一 个更为可靠的动物模型依据,具有广阔的应用前景。 参考文献: 【l 】张洪,江捍平,王大平关节制动制作骨性关节炎动物模型的探 讨阴中国现代医学杂志,2 0 0 6 。1 6 ( 1 2 ) :1 8 4 3 1 8 4 4 【l 】Z H A N GH ,J L A N GH P W A N GD P D i s c I l s s i o n0 f t e ( 蒯t i c 龃曲a lm o d e l 学e t 如mi l n m o b i l i z e dk n e 船0 fm b b
21、 i ti I l 舢e ) 【t 一 s i o nm i l l gp l a s 瞬8 t 叨C h i l l aJ o 哪! a lo fM 0 d e mM e d i c m e 2 0 0 6 ,1 6 ( 1 2 ) :1 8 4 3 一1 8 4 4 C h i n e 瞬 【2 】高仰贤骨性关节炎发病机制的国内研究进展册中医正骨,2 0 0 5 , 1 7 ( 4 ) :5 5 5 6 【2 】G A 0Y XD o m 鄂t i cr e s e a r c hp r 0 9 峭8i np a 出o g e n e s y0 fo 卜 t e 矾r i t i s 啊T
22、 h d 赫o I l a lC h i n e 8 eP h y 6 i c i a l l0 n h o p e d i c s 2 0 Q 5 , 1 7 ( 4 ) :5 5 - 5 6 C h i n e s e 【3 1 孙永生,娄思权骨性关节炎发病分子机制研究进展田冲国骨与 关节损伤杂志,2 0 0 5 ,2 0 ( 8 ) :5 7 1 【3 】S U NY S ,L O US Q A d v a I l c e s i I lI h e8 t u d y 帆m o l e c u l 盯m e c h a - I l i 咖f o r t e o a n h r i t i
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