尼美舒利对人食管癌细胞ECA109 COX2表达及生长的抑制作用.pdf
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1、尼美舒利对人食管癌细胞 Eca-109 COX-2 表达及生长的抑制作用 刘俊茹1,齐凤英1,李 丽1,左连富2,郭建文2, 刘江惠2 (1. 河北医科大学病理学教研室, 河北 石家庄 050017; 2. 河北医科大学肿瘤研究所, 河北 石家庄 050011) 中国图书分类号: R 329. 25; R 329. 28; R 345. 4; R 394. 2; R 73-351; R 735. 1; R 977. 3; R 979. 1 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 09 -1084 -05 摘要: 目的 研究环氧化酶-2 (COX-2) 选择性抑制剂尼美
2、舒 利对人食管癌 Eca-109 细胞株 COX-2 表达和细胞增殖及凋 亡的影响。方法 MTT 法测定尼美舒利对人食管癌 Eca-109 收稿日期: 2005 -01 -04, 修回日期: 2005 -02 -02 基金项目: 河北省自然科学基金资助项目 (No 301354) 作者简介: 刘俊茹 (1969 - ) , 女, 博士生, E-mail: liujr1207 sina. com; 齐凤英 (1945 - ) , 女, 教授, 博士生导师, 通讯作者, 研究 方向: 肿瘤药理, Tel: 0311-6265734, E-mail: qfengying1945 yahoo. com
3、. cn 细胞增殖的抑制率; RT-PCR 法检测 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA 表达变化; 流式细胞仪检测 COX-2 蛋白表达、 细胞周 期时相分布及凋亡率的变化; 光镜和琼脂糖电泳法进一步观 察细胞凋亡。结果 尼美舒利对人食管癌 Eca-109 细胞有 较强的抑制作用, 有明显的时间和浓度依赖性; 呈浓度依赖 性下调 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA 及蛋白表达; 可使 Eca- 109 细胞 G0/ G1期比例增高, S 期细胞减少, 增殖指数降低, 凋亡细胞增多。结论 尼美舒利可能通过对 COX-2 表达的 下调而诱导凋亡和细胞周期阻滞, 从而抑制人食管癌 E
4、ca- 109 细胞生长。 关键词: 尼美舒利; 环氧化酶-2; 人食管癌 Eca-109 细胞株; 凋 亡 2 Sine SM,Claudio T. Gamma- and delta-subunits regulate the af- finity and the cooperativity of ligand binding to the acetylcholine receptor J . J Biol Chem, 1991, 266 (6) : 19369 -77. 3 杨保仲, 庄心良, 赵雪莲 et al. 肌肉型乙酰胆碱受体在 HEK293 细胞上的表达 J . 中国药理学通报,
5、 2004, 20 (10) : 1186 -9. 4 Franks NP,Lieb WR. Temperature dependence of the potency of volatile general anesthetics:implications for in vitro experiments J . Anesthesiology, 1996, 84 (6) : 716 -20. 5 Wright PM,Hart P,Lau M et al. The magnitude and time course of vecuronium potentitation by desflura
6、ne versus isoflurane J . Anesthesiology, 1995, 82 (4) : 404 -11. Effects of sevoflurane on the actions of neuromuscular blockers on the muscle nicotine acetylcholine receptor LI Chuan-xiang1, YAO Shang-long1,NIE Hui2, ZHANG Yu-qin2,L Bin3 (1. Dept of Anesthesiology, Union Hospital, 3. Institute of E
7、nvironment Medical,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022, China; 2. Dept of Physiology,Medical College, Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430080, China) Abstract: Aim To investigate the mechanism of sevoflurane enhancement of muscle relaxati
8、on. Meth- ods Poly (A)+ mRNA isolated from the rat$s muscle were microinjected into Xenopus oocytes to express functional ion channels. Voltage clamp technique was used to record the current of the voltage-dependent ion channels. Concentration-effect curves for the inhibition of acetylcholine-induce
9、d currents were established for sevoflurane, rocuranium and vecuronium. Subsequent- ly, inhibitory effects of NDMRS were studied in the presence of the sevoflurane at a concentration equiva- lent to half the concentration producing a 50% inhibi- tion alone. Results Sevoflurane, rocuranium and ve- cu
10、ronium produced rapid and readily reversible con- centration-dependent inhibition.The 50% inhibitory concentration values were 823 molL -1 (95% CI: 681 997 molL -1) , 33. 4 nmol (95% CI: 27. 1 41. 7 nmolL -1)and 9. 2 nmolL-1 (95% CI: 7. 9 12. 3 nmolL -1) for sevoflurane, rocuranium and vecuronium, r
11、espectively. Coapplication of sevoflurane significantly enhanced the inhibitory effects of rocurani- um and vecuronium. Conclusion Sevoflurane increa- ses the potency of NDMRs,possibly by enhancing an- tagonist affinity at the receptor site. Key words: sevoflurane; nondepolarizing muscle relax- ants
12、;cell membrane;receptors, cholinergic 4801中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep; 21 (9) : 1084 8 近年来研究发现环氧化酶-2 (Cyclooxygenase 2, COX-2) 与多种人类恶性肿瘤的发生密切相关 1 3。 COX-2 选择性抑制剂能诱导多种肿瘤细胞凋亡、 抑 制其生长, 但这种作用是否通过抑制 COX-2 活性而 实现目前尚有很多争论 4。COX-2 抑制剂是否诱 导食管癌细胞凋亡, 其作用机制如何, 目前研究较 少。本实验研究目的在于观察选择性 COX-2
13、抑制 剂尼美舒利 (nimesulide) 对体外培养的 Eca-109 食 管癌细胞 COX-2 表达及细胞增殖和凋亡的影响, 以 期为食管癌的预防和治疗提供依据。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂 尼美舒利 (美国 Caymen 公司出 品, 购自晶美公司) 溶于二甲基亚砜 (DMSO) , 配成 500 mmolL -1母液, 临用前稀释; MTT、 TRIZOL 为 美国 Sigma 公司产品; RPMI1640 购于美国 Gibco 公 司; 羊抗人 COX-2 抗体、 辣根过氧化物酶标记的兔 抗羊 IgG 及 ECL 发光试剂盒购自美国 Santa Cruz 公 司; 反转录酶
14、AMV 及 Taq DNA 聚合酶购自美国 Promega 公司。 1. 2 主要仪器设备 Epics-XL 型流式细胞仪为 美国 Beckman Coulter 公司产品, 使用 Muticycle AV 分析软件;PCR 扩增仪为美国 Biometra 公司产品; 凝胶成像系统为美国 UVP 公司产品; 恒温 CO2培养 箱为日本 SANYO 公司产品。 1. 3 方法 1. 3. 1 细胞培养 人食管癌细胞株 Eca-109 由第 四军医大学实验动物中心提供, 将 Eca-109 细胞置 于含体积分数 10% 胎牛血清、 1 105IUL -1青霉 素及 100 mgL -1链霉素的 R
15、PMI1640 培养液中, 于 37、 5% CO2培养箱中常规培养, 待其贴壁生长至 70% 80% 融合时, 用质量浓度为 2. 5 gL -1的胰 酶和 0. 2 gL -1的 EDTA 混合消化液传代培养。 1. 3. 2 尼美舒利对 Eca-109 细胞生长的影响 取 对数生长期的人食管癌 Eca-109 细胞, 用消化液消 化后, 将细胞以 5 104L -1的浓度接种 200 l 孔 -1于 96 孔板上, 24 h 后轻轻吸去上清, 加入浓度 为 400、 200、 100、 50 molL -1的尼美舒利 200 l, 同时设不含药物的阴性对照孔和等体积的 DMSO 溶剂对照
16、孔, DMSO 的体积分数为0. 08%, 细胞继续 培养 24、 48、 72 h 后每孔加入 MTT (质量浓度为 5 g L -1, 用 0. 01 molL-1 PBS 配制) 20 l, 继续培养 4 h, 弃去上清后每孔加入200 l 浓度为0. 04 mol L -1的酸化异丙醇, 振荡 10 min 充分溶解结晶后用 酶标仪于 490 nm 下读取每孔的光吸收值 (OD) , 每 浓度每时间点设 6 孔。并通过下列公式计算细胞生 长抑制率: 生长抑制率 (%)=(1 - 实验组 OD 值/ 对照组 OD 值) 100%。 1. 3. 3 RT-PCR 检测 COX-2 的 mR
17、NA 表达 不同 浓度的尼美舒利处理细胞 48 h 后, 按 TRIZOL 试剂 盒说明一步法提取总 RNA, 紫外分光光度仪测定 RNA 纯度并定量。逆转录反应合成第一链 cDNA, 进行 PCR 反应, COX-2 引物上游序列为: 5-AGAAT- GCATTGGAAACATCGACAG-3下游序列为: 5-CCT- GTTGCGGAGAAAGGAGTC-3。内 参 GAPDH 引 物 的上游序列为: 5-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC- 3, 下游序列为: 5-TTCTAGACGGCAGCTCAGGTC- 3。反应条件为: 95 预变性 5 min 后, 95 变性 1
18、min, 55退火 50 s, 72延伸 50 s, 共 35 个循环, 最 后 72延伸 10 min。5 l PCR 产物在 20 gL -1琼 脂糖凝胶中电泳, 溴化乙锭显色, 目的条带用凝胶成 像分析系统作光密度测定, COX-2 与 GAPDH 光密 度的比值作为 COX-2 mRNA 的相对含量。 1. 3. 4 流式细胞仪免疫荧光标记法分析 COX-2 蛋 白表达 用不同浓度的尼美舒利处理细胞 48 h 后, 收集细胞用体积分数为 0. 70 的乙醇固定, 加入羊抗 人 COX-2 抗体, 室温孵育 30 min, PBS 洗涤后加入 FITC-IgG 二抗, 上机检测。蛋白表达
19、量用荧光指数 (fluoresence index, FI) 表示, FI = 实验处理组的荧光 强度/ 实验对照组的荧光强度。 1.3. 5 光镜观察细胞形态 不同浓度的尼美舒利 处理 6 孔板内爬片培养的细胞 72 h 后, 取出内置的 盖玻片, 用体积分数为 0. 95 的乙醇固定后, 行 HE 染色, 观察细胞的形态学改变。 1.3. 6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 收集 不同浓度尼美舒利处理 72 h 的细胞, 每组重复 3 瓶, PBS 洗 3 次, 用体积分数为 0. 70 的乙醇固定, PI 染液 (含质量浓度50 mgL -1的 PI, 体积分数1. 0% 的 Trito
20、n X-100 和质量浓度 10 mgL -1 Rnase A) , 4避光染色 30 min, 用 Epics-XL 型流式细胞仪 检测细胞凋亡率、 增殖指数和细胞周期分布。增殖 指数 = (S 期 + G2M 期) 细胞数/ (G0/ G1期 + S 期 + G2M 期) 细胞数。 1. 3. 7 细胞凋亡的 DNA 片断检测 参照 Smith 等 5方法略有改进。收集溶剂组和 100、 200、 400 molL -1尼美舒利组培养 72 h 细胞, PBS 洗 2 次, 溶于 400 l 裂解液 1% NP40、 500 mmolL -1 Tris. HCl(pH 8. 0)20 mm
21、olL -1 EDTA , 55水浴 16 h, 离心, 取上清加入终浓度为 20 mgL -1 的 RNA 酶A、 1% SDS37 水浴1h, 加入蛋白酶K至终浓 5801中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep; 21 (9) Tab 1 Inhibitory effect of growth of Eca-109 cells cultured with different concentrations of nimesulide(*x s, n =6) Group 24 h OD490IR/ % 48 h OD490IR/ %
22、72 h OD490IR/ % Control0.297 0.014-0. 544 0. 005-1. 045 0.033- DMSO0.293 0.0231.40. 529 0. 0232. 81. 007 0. 0283. 6 Nimesulide/ moll -1 500.295 0.0110.70. 515 0. 020*5. 30. 913 0. 027*12. 6 1000.284 0.009*4.40. 485 0. 007*10. 90. 677 0. 035*35. 2 2000.253 0.015*15.70. 407 0. 032*35. 10. 531 0. 018*4
23、9. 2 4000.199 0.013*32.90. 254 0. 017*53. 30. 330 0. 014*68. 4 *P 0. 01 vs DMSO group; IR:inhibition rate 度 20 mgL -1, 37水浴1 h, 加入1/10 体积3 mol L -1的醋酸钠及 2 倍体积的冰乙醇, -20放置 1 h 以上, 离心, 沉淀溶于 pH 8. 0 的 TE 液中, 18 g L -1琼脂糖凝胶电泳鉴定, 自动凝胶成像系统摄影。 1. 3. 8 实验资料的统计学处理 实验数据均用*x s 表示, 采用 SPSS 12. 0 统计软件行方差分析和直 线回归相
24、关分析。 2 结果 2.1 尼美舒利对 Eca-109 细胞生长抑制作用 50 400 molL -1 尼美舒利作用 Eca-109 细胞 24、 48、 72 h 后, 可抑制细胞的生长, 随着尼美舒利剂量 的增加和作用时间的延长, 其对 Eca-109 细胞的抑 制作用明显增强 (P 0. 01, Tab 1) , 相关分析表明 呈时间和浓度依赖性 (r = 0. 917 0. 996, P 0. 05 或 P 0. 01) 。 2. 2 尼美舒利对 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA、 蛋 白表达的影响 尼美舒利处理 Eca-109 细胞 48 h 后, COX-2 mRNA 及
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