慢性低灌注对大鼠基底前脑胆碱能系统及认知功能的影响.pdf
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1、!实用医药杂志2006年04月第23卷第04期Prac J Med 42)?。 9.2主要实验仪器及试剂MA型迷宫,江苏张 家港医用仪器厂;BPCD;A9000图像测量分析系统, MedEaFGHerIeJEcK;胆 碱 乙 酰 转 移 酶 (FholEIe ! 基础研究 ! 慢性低灌注对大鼠基底前脑胆碱能系统 及认知功能的影响 李永生陈皓王玉宾倪灿荣 (9L3医院神经内科,河南郑州4L004L;郑州大学第一附院手术室,河南郑州4L00L2; 上海长海医院病理科,上海 200433) 8摘要M目的探讨慢性低灌注状态对大鼠基底前脑胆碱能神经系统及认知功能的影响。 方法永久 结扎;?)、 大鼠单克
2、隆抗体, 来自 ABma公司。 CD3实验分组及慢性低灌注状态大鼠模型的建立 随机将E大鼠60只分为对照组及低灌注组各 30只;低灌注组根据术后饲养时间不同,分为C、2 及4个月三组,每组C0只,对照组同样依此分法; 分别编号、称重、分笼,在动物房内20F、明暗交替 C2h饲养。 参照文献G2H制作慢性脑灌注不足动物模型的 方法,低灌注组大鼠术前C2h禁食,4h禁水,20I乌 拉坦JCBKLBM腹腔注射麻醉成功后,仰卧固定于手术 台上,取颈正中切口,纵向切开皮肤及皮下组织,钝 性分离暴露双侧颈总动脉, 其下置NO0手术线,注 意避免刺激迷走神经, 小心结扎双侧颈总动脉;对 照组仅纵向切开颈正中
3、皮肤及皮下组织,钝性分离 暴露双侧颈总动脉, 然后直接缝合皮肤; 术中用 C00P日光灯照射,保持肛温36DQR3NDQF,术后动物 送至有通风和空调设备的动物房饲养,术后死亡动 物,均不入组统计。 CD4大鼠认知功能测试S3,4H CD4DCMTU2型 “V“ 迷宫设置参数电刺激参数 是:电压Q0RN0V,延时2RQ;。 CD4D2训练方法采用随机休息法,安全区以无规 则次序变换,以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位 的能力。 以大鼠所在支臂作为测试的起点,大鼠受 电击后逃到安全区后,灯光继续作用C0RCQ;,熄灯 后结束一次测试,两次测试时间间隔为30;或休息 CmA:后再予以第2次测试,依次
4、重复。 每天固定训 练次数为20次,连续训练3R4d。 CD4D3测试指标正误判定的标准:大鼠在足底通 电后C0;内一次性跑向安全区为正确反应W否则为 错误反应,向所在的起步区逆向逃窜也应归为“错 误反应“;错误次数XYrror :Zmer5Y7:指每天训练 中出现错误反应的次数,一般每天训练20次,该指 标反映大鼠反应的正确程度; 全天总反应时间 (?o8al reac8Ao: 8Ame,?):动物的反应时间J潜伏 期指从信号灯亮开始至大鼠第C次逃至灯亮区为 止所耗的时间, 全天总反应时间是一个实验日J全 天完成所有反应J包括正确反应和错误反应所需时 间,该指标反映大鼠反应时间的长短,可综合
5、评价 大鼠的学习记忆能力。 C.4.4认知功能障碍的标准及计算对照组及低 灌注组分别在C、2及4个月开始训练并测试。 每实 验日进行20次训练测试, 以Y72次作为判定大 鼠学会的标准,记录当日?数值W计算各组大鼠 ?的均数标准差。 C.Q基底前脑组织标本切片_Y染色C0中性 甲醛缓冲液固定,以视交叉、乳头体中部,平行大脑 后缘与小脑的连线, 自后向前、 冠状连续4m切 片,苏木素染色QmA:,双蒸水洗片CmA:,盐酸乙醇 分化30;,温水浸泡QmA:后置伊红液2mA:,干燥封 片,光镜下观察基底前脑的病理改变。 CD6基底前脑=h?免疫组织化学染色(a=法) CD6DC灌注和切片用20乌拉坦
6、XCBKLB腹腔注 射麻醉成功后,暴露心脏,先以0Db盐水约Q00ml 经升主动脉灌注冲洗后,灌注4多聚甲醛溶液(c_ N.4)Q00ml,持续2h后取脑,将脑置于20蔗糖溶液 中浸置24d4eh(4F),冰冻后冠状连续切片(厚度 Q0m)。 CD6D2免疫组织化学染色步骤切片置于0D3I ?rA8o:中浸30mA:,Pa液洗3次,每次CQmA:,以下 各操作后均经Pa液漂洗;=h?大鼠单克隆抗体 中孵育4eh;生物素标记二抗(CfC00)中,室温下孵 育30mA:;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(CgC00) 中,室温下孵育30mA:;二氨基联苯氨(Ea)反应液 中显色,室温下C0d20mA:
7、;常规明胶裱片、脱水、透 明、EPh封片。 染色结果均设阳性、阴性对照,已知 的阳性切片作为阳性对照,用Pa代替一抗作为阴 性对照,结果呈综黄色。 CD6D3免疫组化图像分析应用_PiUC000图像 测量分析系统,每张切片随机选定Q个阳性细胞的 阳性区域进行集合光密度(i:8eBra8ed oc8Ac de:;A89W ijE)测量,进而求出每张切片平均ijE标准差,统 计学处理。 CDN统计学分析采用统计软件 (由第二军 医大学统计教研室提供,公司授权),两组间比 较采用t检验;多组比较采用方差分析;两组关系采 用直线相关分析,相关系数采用t检验。 2结果 2DC行为学及学习记忆能力的改变
8、2DCDC低灌注模型大鼠行为学观察模型大鼠双 侧颈总动脉完全阻断后,首先出现短暂惊厥,翻正 反射消失,伴有体温降低,呼吸减慢;术后早期观察 动物运动减少,爬行时后肢呈“八字“,有共济失调、 转圈现象;术后QdNd各组爬行基本恢复,无明显的 运动障碍。 2DCD2低灌注模型大鼠学习记忆能力的改变“V“ 迷宫认知功能测试结果发现,低灌注组模型建立后 C、2及4个月时,与对照组比较,大鼠?明显延 长(Pk0D0C);低灌注模型大鼠随阻断时间延长? 444 !实用医药杂志2006年04月第23卷第04期Prac J Med 0.08免疫组织化学结果对 照组海马=:区、门区和齿状回均有大量=h8免 疫反
9、应阳性神经元和纤维分布,其中以海马锥体细 胞层和颗粒细胞层最密集, 其次为海马腔隙分子 层、齿状回分子层和海马门等区域,辐射层相对较 稀疏; 低灌注组=h8免疫反应阳性神经元和纤维 明显稀疏,与对照组比较,经图像分析仪扫描、相对 应时间点的=h8免疫反应阳性神经元集合光密度 明显降低(P;0?0:);从低灌注组内分析看,=h8免 疫反应阳性神经元密度随时间增加而逐渐降低,至 术后4个月时降低最为明显,与术后:个月比较差 别显著(P;0?08免 疫反应阳性神经元密度的相关性随时间延长, 898值与基底前脑组织=h8免疫反应阳性神经元 密度呈显著负相关:rA0?B3,经t检验,P;0?0:。 3讨
10、论 大鼠双侧颈总动脉结扎后脑部供血低于正常水 平、 呈低灌注状态比较符合老年动脉粥样硬化所致 颈狭窄后的病理过程。 在以往研究中,8CDchEFa等G=hR)、 胆碱乙酰转移酶 (=S8) 含量均有显著下降; TredrEUCCoL等G:0H报道VaV患者脑脊液中=hR活性 明显下降;从本实验结果来看,大鼠脑低灌注模型 建立后W基底前脑组织中=h8阳性神经元及纤维 显著减少,随时间延长而逐渐加重,呈不可逆性持 续进展, 与基底前脑组织病理变化呈平行关系,并 且出现大鼠学习和记忆能力的下降,说明由于低灌 注状态导致基底前脑胆碱能神经系统损害,是认知 功能障碍形成的重要机制。 由于=h8水平反映了
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