异丙酚对缺氧复氧大鼠海马胶质细胞凋亡及BCL2和BAX蛋白表达的影响.pdf
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1、李清等异丙酚对缺氧复氧大鼠海马胶质细胞凋亡及B c l - 2 和B “蛋白表达的影响 4 9 5 异丙酚对缺氧复氧大鼠海马胶质细胞凋亡 及B c l 2 和B a x 蛋白表达的影响 李 清, 周龙,秦成名, 刘菊英, 王贤裕 ( 郧阳医学院附属太和医院麻醉科,湖北十堰4 4 2 0 0 0 ) 摘要 目的:观察异丙酚对缺氧复氧大鼠海马胶质细胞凋亡及B e l - 2 和B a x 蛋白表达的影响。方法:取新生2 3dW i s t a r 大鼠海马星形胶质细胞,原代纯化培养3 周。将细胞分为正常对照组,乳剂对照组,缺氧4h 后复氧1 2 h 、2 4h 、3 6h 、4 8h 、6 0h
2、、7 2h 组,加异丙酚2 5 0i z m o V L 缺氧4h 后复氧1 2h 、2 4h 、3 6h 、4 8h 、6 0h 、7 2h 组。分别于 各时间点检测每组细胞凋亡及B e l - 2 和B a x 蛋白表达变化。站杲:与正常对照组比较,缺氧复氧组细胞随着时间延 长凋亡不断增加,B e l - 2 蛋白2 4h 时间点表达最高,随后逐渐降低,B a x 蛋白2 4h 表达低,随着时间延长不断增加, 7 2h 时间点最高,B e l - 2 B a x 蛋白比值于2 4h 、4 8h 和7 2h 时间点分别为1 4 、0 8 和0 6 。与缺氧复氧组比较,异丙 酚处理组凋亡明显减
3、少,B a x 蛋白表达降低,B c l - 2 蛋白2 4h 内表达升高达峰值,此后有所降低但仍维持较高水平, 且B c l - 2 蛋白表达持续高于B a x 蛋白,B c l - 2 B a x 蛋白比值保持在1 6 1 8 之间。结论:异丙酚可抑制缺氧复氧后 海马反应性星形胶质细胞表达B c l - 2 和B a x 蛋白的动态变化,使B c l - 2 B a x 蛋白比值持续保持较高水平而发挥良好 的保护作用。 关键词 异丙酚;海马星形胶质细胞;凋亡;缺氧复氧;B c l - 2 ;B a x 中图法分类号 R 3 3 8 2 6 文献标识码】 A 文章编号1 0 0 6 9 6
4、7 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 4 9 5 0 4 E f f e c t so fP r o p o f o lo nA p o p t o s i sa n dt h eE x p r e s s i o no fB c l - 2a n d B a xo nP r i m a r yC u l t u r e dH i p p o c a m p a lA s t r o - c y t e sw i t hA n o x i aa n dR e - o x y g e n a t i o ni nR a t s L IQ i n g ,Z H O UL o n g ,Q I
5、 NC h e n g m i n g ,L I UJ u - y i n g ,W A N GX i a n - y u ( D e p a r t m e n t0 ,A n e s t h e s i o l o g y ,T a i h eH o s p i t a l ,Y u n y a n gM e d i c a lC o l l e g e ,S h i y a n ,H u b e i4 4 2 0 0 0 ,C h i n a ) A b s t r a c t :O b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ee f f e
6、c t so fp r o p o f o lo na p o p t o s i sa n dt h ed y n a m i cc h a n g e so fB c l - 2a n dB a xe x p r e s s i o n si np r i m a r yc u l t u r e dh i p p o c a m p a la s t r o c y t e si nr a t si nr e s p o n s et oa n o x i aa n dr e o x y g e n a t i o n M e t h o d s H i p p o c a m p a
7、la S - t r o c y t e si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mn e o n a t a lw i s t a rr a t s ( 2 3d a y s ) w e r ec u l t u r e df o r3w e e k s T h ec e l l sw e r et r e a t e da S f o l l o w s :n o r m a lc o n t r o lg r o u p ,l i p i dv e h i c l eg r o u p ,4ha n o x i aa n d1 2h ,2 4h
8、 ,3 6h ,4 8h ,6 0h ,7 2hr e o x y g e n a t i o ng r o u p s , 4ha n o x i aa n d1 2h ,2 4h ,3 6h ,4 8h ,6 0h ,7 2hr e o x y g e n a t i o na f t e ra d d e dp r o p o f o l2 5 0 F m o l Lg r o u p s T h ea p o p t o s i so f c e l l sa n dt h ee x p r e s s i o no fB c l - 2a n dB a xp r o t e i nw
9、 e r ed e t e r m i n e da ta l lt h et i m ep o i n t s ,r e s p e c t i v e l y R e s u l t sC o m p a r e d w i t hn o r m a lc o n t r o lg r o u p ,t h ea p o p t o s i si n d e xw e r ei n c r e a s e dw i t ht i m ep r o l o n g e di na n o x i ar e - o x y g e n a t i o ng r o u p s ,t h ee
10、x - p r e s s i o no fB c l - 2p r o t e i nr e a c h e dt h ep e a kl e v e la t2 4ha n dt h e nd e c r e a s e dg r a d u a l l y ,t h ee x p r e s s i o no fB a xp r o t e i nw a sl o w a t2 4 ha n di n c r e a s e dw i t ht i m ep r o l o n g e d ,r e a c h e dt h ep e a kl e v e la t7 2 h ,t h
11、er a t i o so fB e l - 2 B a xp r o t e i na tt h ep o i n t so f2 4 h ,4 8ha n d7 2hw e r eI 4 ,0 8a n d0 6 ,r e s p e c t i v e l y C o m p a r e dw i t ha n o x i ar e o x y g e n a t i o ng r o u p s ,t h ea p o t o s i sW a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi np r o p e f o lg r o u p
12、,t h ee x p r e s s i o no fB a xp r o t e i nw a sd e c r e a s e d ,t h ee x p r e s s i o no fB c l - 2r e a c h e dt h ep e a k l e v e lw i t h i n2 4h s ,t h e r e a f t e rd e c r e a s e ds l i g h d yb u ts t i l lm a i n t a i n e dah i 【S h l e v e l ,a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e
13、lo fB c l - 2W a sS U S - t a i n a b l eh i g h e rt h a nB a x ,t h er a t i o o fB c l - 2 B a xp r o t e i nw a sk e e p i n gi n1 6 1 8 C o n c l u s i o nP r o p o f o lc a ni n h i b i tt h ed y - n a m i cc h a n g e so fB c l - 2a n dB a xe x p r e s s i o ni nh i p p o c a m p a la s t r o
14、 c y t e sw i t ha n o x i aa n dr e o x y g e n a t i o n ,a n dp l a yap r o t e c t i v e r o l eb yk e e p i n gt h er a t i oo fB c l - 2 B a xp r o t e i na th i g h h v e l K e yw o r d s :P r o p o f o l ;H i p p o c a m p a la s t r o c y t e ;A p o p t o s i s ;A n o x i aa n dr e o x y g
15、e n a t i o n ;B c l - 2 ;B a x 作者简介】李清( 1 9 7 3 一) ,男,湖北房县人。讲师,医学 博士生,主要从事脑保护研究。 通讯作者王贤裕( 1 9 7 0 一) ,男,湖北郧县人,副教授, 医学博士,主要从事器官保护研究,E m a i l :w x y t j 1 2 6 c o n l 。 研究表明在脑缺血缺氧损伤过程中会诱发星形 胶质细胞大量凋亡并进一步影响大脑功能:,而海 马区星形胶质细胞对缺血性损伤较神经元更为敏 感:2 1 。星形胶质细胞的凋亡是如何发生的? 又是从 万方数据 4 9 6 郧阳医学院学报( JY M C ) 2 0 0 8
16、年1 2 月,2 7 ( 6 ) :4 9 5 何时开始的? 如何实施有效的神经保护? 这些问题 都有待进一步深入研究。异丙酚是临床常用的静脉 全麻药,是G A B A 受体激动剂,它有显著的脑保护 作用H J ,但其作用机制尚不完全清楚。本实验通过 离体原代纯化培养大鼠海马星形胶质细胞,观察异 丙酚对缺氧复氧诱导海马星形胶质细胞凋亡及B c l - 2 和B a x 蛋白表达动态变化的影响,进一步探讨异 丙酚的脑保护机制。 1 材料与方法 1 1 动物、主要仪器和试剂 出生l 一3dW i s t a r 大鼠3 0 只,雌雄各半,体重 l O 1 5g ( 郧阳医学院实验动物中心) ;C
17、B l 5 0 细胞 培养箱( B i n d e r 公司,德国) ;E P I C SX L 流式细胞仪 ( B e c k m a nc u l t u r e 公司,美国) ;D M E M F 1 2 、胎牛血 清和小牛血清( H y C l o n e 公司,美国) ;D N A 流式检 测试剂盒和F l u o - 3 一A M ( C o u l t e r 公司,美国) ;兔抗 鼠B a x 抗体试剂盒和兔抗鼠B c l - 2 抗体试剂盒( 北 京中山生物技术有限公司) 。 1 2 星形胶质细胞原代培养 出生2 3dW i s t a r 大鼠麻醉后,无菌环境下取 大脑海马
18、组织,加人0 1 2 5 胰蛋白酶置3 7 、5 C O :细胞培养箱中消化3 0m i n ,将细胞悬液接种于 培养瓶内( 细胞培养基为含1 0 胎牛血清和5 小 牛血清及0 3 葡萄糖的D M E M F 1 2 ) ,培养7 9d 后置于J 8 0 转m i n 恒温摇床上摇1 5h ,将其传代接 种在2 4 孔培养板中,细胞接种密度为5X1 0 5 m L ,3 7d 后通过细胞鉴定即可用于细胞凋亡、B c l - 2 和 B a x 蛋白表达检测。免疫细胞化学法鉴定培养的细 胞,胶质纤维酸性蛋白( G F A P ) 阳性细胞为星形胶 质细胞。 1 3 实验分组 将细胞分为1 4 组
19、,每组9 孔细胞。正常对照组 ( C 组) ,加入H a n k s 液5 0 斗l ;乳剂对照组( L 组) ,加 人乳剂0 2m L L ;缺氧复氧组( A R 组,各时间点共 六组) :先加入H a n k s 液5 0 斗l ,1 0r a i n 后行缺氧培养 4h 再分别复氧培养1 2h ( A R l 2 ) 、2 4h ( A R 2 4 ) 、3 6h ( A R 3 6 ) 、4 8h ( A R 4 8 ) 、6 0h ( A R 6 0 ) 、7 2h ( A R 7 2 ) ;加异 丙酚后缺氧复氧组( P A 组,各时间点共六组) :先加 异丙酚至终浓度2 5 0i
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