弓形虫表面抗原SAG3基因和IL2基因佐剂混合诱导小鼠免疫应答研究.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 1 1 - 0 9 4 5 - 0 4 弓形虫表面抗原S A G 3基因和I L - 2基因佐剂混合 诱导小鼠免疫应答研究* 周永安1 *, 余新炳1, 陈海峰3, 郑焕钦1, 殷国荣2, 吴忠道1, 陈观今1 摘要: 目的了解编码S A G 3的重组质粒和I L - 2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应, 为进一步的核酸疫苗及免疫学研究 创造条件。方法将编码S A G 3的质粒和鼠源性I L - 2表达载体以1 0 0 g的剂量感染小鼠, 3周中两次以相同的剂量加强免 疫, 分别以P B S和空质粒p c D N A 3 . 1感
2、染。采用E L I S A法测定抗体水平、 亚型、 I F N - 、I L - 4和I L - 2的含量,R T - P C R方法检测 注射部位目的基因的转录, 所有鼠均由强毒力Z S 2株弓形虫感染。结果 S A G 3表达质粒3次免疫后鼠体内特异I g G水平明 显上升, I L - 2表达质粒的联合使用导致I g G 2 a水平的升高和I F N - 的产生, 提高了其分泌I L - 2的水平, 但对I L - 4的水平产生 轻微的影响; R T - P C R显示首次使用导致I g G 2 a水平的升高和I F N - 的产生, 提高了其分泌I L - 2的水平, 但对I L -
3、4的水平产 生轻微的影响; R T - P C R显示首次免疫1 5天后, 目的基因在肌肉组织中仍有表达; 混合质粒注射和小鼠抗弓形虫感染的存活 时间延长。结论由S A G 3D N A诱导的免疫应答因I L - 2表达质粒的共同注射而增强, D N A疫苗和适当细胞因子的共注射对 抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究。 关键词: D N A免疫; 弓形虫表面抗原S A G 3; 基因佐剂; 免疫应答 中图分类号: R 3 8 2 , 5 文献标识码: - I n d u c t i o no f i LL u n e r e s p o n s e s i nL i c eb y t h e
4、c o L b i n e du s e o f t h e r e c o L b i n a n t p l a s L i de n c o d i n g t h e s u r f a c e a n t i g e nS A G 3o f T o x o p l a s ag o n d i ia n d t h e I L - 2g e n e a d j u v a n t Z H O UY o n g - a n,Y UX i n - b i n g,C H E NH a i - f e n g,Z H E N GH u a n - q i n Y I NG u o - r
5、o n g,WYZ h o n g - d a o , C H E NG u a n - j i n (D e p a r t m e n t o fP a t h o g e n - b i o l o g y, Z h o n g s h aC o l l e g e,S u nY a t - S e nU n i v e r s i t y,G u a n g z h o n g5 1 0 0 8 9,C h i n a) A B S T R A C T:M i c ew e r e c o - i n j e c t e d i n t r t a m u s c u l a r l
6、yw i t h t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i de n c o d i n g t h e s u r f a c e a n t i g e nS A G 3o fT o x o - p l a s m ag o n d i ip l u sm u r i n e e x p r e s s i o nv e c t o r f o r I L - 2a t t h e d o s a g e o f 1 0 0 g . B o o s t e r i m m u n i z a t i o n sw e r ep e r f o r m
7、e dw i t h t h e s a m e d o s e s 2 t i m e s a t 3w e e k s i n t e r v a l . A s c o n t r o l sm i c ew e r e i n o c u l a t e dw i t hP B S a n d t h e e m p t yp l a s m i dp c D N A 3 . 1 r e s p e c t i v e l y . E L I S A a s s a yw a s e m p l o y e d t o d e t e r m i n e a n t i b o d y
8、 l e v e l s,a n t i b o d y i s o t y p e s a n d t h e a m o u n t s o f I F N - ,I L - 4 a n d I L - 2;a n dP T - P C Rw a s u s e d t o e v a l u a t e t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e i n o c u l a t e d t a r g e tD N Ac o m p l e x i n i n j e c t e d s i t e s . A l lm i c ew e r e
9、c o n d u c t e d t o b e c h a l l e n g e dw i t h t h e t a c h y z o i t e s o f h i g h l y v i r u l e n t s t r a i nZ S 2 o fT.g o n d i it h r o u g h t h e i n t r a p e r i t o n e a l r o u t e . I tw a s f o u n d t h a t s i g n i f i c a n t s p e c i f i c I g G l e v e l c o u l db
10、e d e t e c t e d i nm i c e a f t e r t h r e e i m m u n i z a t i o n s b y t h e e x p r e s s i o np l a s m i dw i t hS A G 3 . I n r e s p e c t t o t h e I g G i s o t y p e s,c o - i n o c u l a - t i o nw i t h t h e e x p r e s s i o np l a s m i dw i t h I L - 2e n h a n c e d t h e l e
11、v e l o f I g G 2 a a n d t h e p r o d u c t i o no f I F N - . A s d e m o n s t r a t e db yR T - P C R, t h e d u r a t i o no f t h e t r a n s c r i b e dD N Ai n o c u l a t e d i nt h e i n j e c t e dm u s c u l a r t i s s u e sw a s a t l e a s t 1 5d a y s a f t e r t h e f i r s t i n o
12、 c u l a t i o n . T h e s u r v i v a l t i m e o fm i c e a f t e r i m m u n i z a t i o nw i t h t h e c o m b i n e dp l a s m i d s a f t e r c h a l l e n g i n gw i t ht h eZ S2t a c h y z o i t e sw a sp r o l o n g e d . I t i s c o n c l u d e d f r o mt h e r e s u l t s o f t h e p r e
13、s e n t s t u d y t h a t t h e i m m u n e r e s p o n s e s i n d u c e db y t h e c o m b i n e du s eo f t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d e n c o d i n gS A G 3o fT.g o n d i ia n d t h e I L - 2g e n e a d j u v a n t c a nb e e n h a n c e d . K E YWO R D S:D N Ai m m u n i z a t i o n
14、;T o x o p l a s m ag o n d i I;s u r f a c e a n t i g e n3 (S A G 3) ; g e n e a d j u v a n t;i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s e 弓形虫 (T. g o n d i i) 是一种专性细胞内寄生原 虫, 可感染所有动物细胞。虽然正常宿主感染常无 症状或无临床症状, 但仍然是一种重要的机会性感 染原虫 1 , 处于免疫抑制状态的宿主如艾滋病人、 *本项目受国家自然科学基金 (N O. 3 0 0 7 0 6 8 2) , “2 1 1工程” 重点学 科
15、建设基金, 广东省首批自然科学团队基金资助 *通讯作者: 作者单位: 1 .中山大学中山医学院病原生物学部, 广州5 1 0 0 8 9; 2 .山西医科大学寄生虫学教研室, 太原0 3 0 0 0 1; 3 .陈海峰:B i o l o g i c a l S c i e n c e sD e p a r t m e n t,S t a t eU n i v e r s i t y o fN e wY o r k,B u f f a l o,1 4 2 6 0N Y,U S A 549 2 0 0 5,2 1(1 1) 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o
16、u r n a l o f Z o o n o s e s 骨髓或其它器官移植病人或者先天性感染胎儿, 则 常引起严重后果甚至危及生命 2 - 3 。因此, 研制安 全有效疫苗对控制弓形虫感染、 优生优育都具有重 要意义。 D N A免疫是近年建立及发展新的免疫学理论 和技术。其基本原理是将抗原编码基因克隆到质粒 D N A中, 并直接接种机体在真核表达调控元件的调 控下, 在接种的宿主细胞中表达, 并以类似自然感染 的抗提呈方式, 诱生特异性的免疫反应。疫苗在几 种模型中的研究结果显示它可诱导强烈的体液、 细 胞免疫反应, 其包括: 抗体, 细胞毒性淋巴细胞, T -细 胞增殖及抗攻击感染的
17、保护效应。 宿主抗弓形虫感染过程中细胞因子起着重要的 作用 4 , 无论是控制急性或慢性弓形虫感染, T H - 1 反应都扮演重要的角色 5 。由于对特异受体高亲 和性, 细胞因子作为免疫佐剂可以增强各种免疫反 应 6 - 7 。然而过去的十几年这种疫苗技术在弓形 虫研究中不多, 作为一种T H - 1型细胞因子, I L - 2何 以增强抗感染的保护作用。我们以往的研究表明 S A S G 1基因的D N A免疫效果因注射编码I F N - 的 重组质粒而增强 8 , 基于此。本文自行设计一对引 物, 应用P C R技术在体外扩增弓形虫S A G 3基因, 定向克隆入真核表达质粒p c D
18、 N A 3 . 1中, 构建p c - S A G 3的真核重组表达质粒, 将其与p c I L - 2一起直 接免疫B A L B c小鼠, 观察并检测其B A L B c小鼠 产生体液、 细胞免疫应答水平及免疫鼠抗弓形虫感 染的效果, 以探索弓形虫疫苗研制的新途径。 1 材料和方法 1 “ 1 质粒、 菌株、 虫株和虫株质粒p c D N A 3 . 1和 p c I L - 2均为本室保存。大肠杆菌J M 1 0 9为本室保 存。弓形虫R H、 Z S 2株为本室从人体分离, 并传代 保种。感染昆明小鼠腹腔后收集。R H株与Z S 2株 均为鼠强毒力株, 用于获得S A G 3基因。5
19、6 W的 B A L B c小鼠由本校实验动物中心购买, 用于免疫 实验。 1 “ # 主 要 试 剂 及 工 具 酶 T a q D N A聚 合 酶 (P r o m e g a公司) 、 d N T P、T r i s、H i n d 、B a nH、X h o 、T 4 - D N A连接酶等购自华美生物工程公司, 蛋白 酶K为S i g m a公司产品; 其它常规试剂为国产分析 纯。 1 “ $ 表达载体的构建从Z S 2株弓形虫基因组 D N A中P C R扩增S A G 3基因片段, 克隆到p c D - N A 3 . 1多接头区域的H i n d B a m H位点构建重组
20、质粒载体p c S A G 3。S A G 3基因的上游引物含H i n d 位点和A T G启动子, 下游引物含B a m H位点和 终止子。P C R产物测序以确认无P C R突变。质粒 p c D N A 3 - I L - 2 (p c I L - 2) 由本室保存。阴离子交换层 析法 (G e n e p u r e p l a s m i dm i d i k i t, R o c h e) 纯化来提纯 E.c o l iJ M 1 0 9的质粒D N A, 并溶于无菌P B S中,- 2 0 0 保存备用。D N A浓度根据2 6 0 n m的吸收值 计算, 纯化的D N AO
21、D 2 6 0 2 8 0为1 . 8 02 . 0, 说明 无蛋白质污染。 1 “ % 免疫方式雌性& W龄B A L B c小鼠分成 以下几组: 1)P B S (n E 1 0) ; 2)p c D N A 3 . 1 (n E 1 0) ; 3) p c S A G 3 (nE1 0) ; 4)p c S A G 3+p c I L - 2 (nE1 0) 。用 0 . 1 m l的针筒在股四头肌部位注射1 0 0gD N A或 1 0 0g D N A与p c I L - 2。3次注射D N A剂量相同, 3 W后同样方式加强免疫。 1 “ & R T - P C R检测肌肉中的m
22、R N A 采用T R I z o l 试剂 (G o b c o产品, 美国) 从质粒p S A G 3注射部位肌 肉组织中抽提总D N A。抽提R N A的终浓度为 1g m l。采用R T - P C R检测p S A G 3m R N A来判断 注射的D N A指质体复合物的存在时间。S A G 3基 因的引物序列为: P 1:5- T T AT C TA G AA T GC A G C T GT G G C G G C G C A G A- 3 , :5- T A T G G A T C CT T AG G CA G CC A CA T GC A CA A G- 3 。其 扩增片段长
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- 关 键 词:
- 弓形虫 表面抗原 SAG3 基因 IL2 佐剂 混合 诱导 小鼠 免疫 应答 研究
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