恩诺沙星完全抗原的合成及其偶联条件的初步优化.pdf
《恩诺沙星完全抗原的合成及其偶联条件的初步优化.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《恩诺沙星完全抗原的合成及其偶联条件的初步优化.pdf(6页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第 6卷第 1 推 2 006 年3 月 中 国 食 品 学 报 J o u rna l 砧C h i n e s e I n s ti t u te o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l og y V o l . 6 No . 1 Ma n 2 0 0 6 恩诺沙星完全抗原的合成及其偶联条件的初步优化 隋建新林洪刘春娥曹立民江洁李振兴 ( 中国海洋大学水生生物制品安全性实脸室青岛 2 6 6 0 0 3 ) 摘 要采用破二亚胺法合成了恩诺沙星的完全杭原, 通过紫外 光谙、 激光解析飞行质语等手段对完 全杭原的 合成效果 进行了分析。以B
2、A L B / C小及的 杭血清 效价为 指标, 利用正交试脸对完全杭原制 备过程中的儿个影响 因素进 行了 优化。 结 果表明: 载体蛋白 具有较为明 显的影响, 其中 鸡血清白 蛋白( O V A ) 的 效果最好; 沙星与 蛋白 的物质的量比为7 5 : 1偶联时间为2 4 h 经脸证, 恩诺沙星完全杭原合成条件的优化筛选取得了预期的效果。 关 键 词 文 童 编 号 恩 诺 沙 星完 全 杭 原偶 联 条 件 1 0 0 9 - 7 8 4 8 ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 1 6 7 - 0 6 氟 喳 诺 酮 类( F l u o r o q u i n o l o n
3、e s , F Q s ) 为 一 族 人 工合 成的杀菌性抗菌药物, 属第3 代唆诺酮类药 物, 广泛用于水产及畜禽养殖, 现已经成为我国 常 用的 渔药和兽药之一。 恩诺沙星(E n r o fl o x a c i n , E 哟 又 名乙 基环丙沙星, 是F Q , 的典型代表之一n 1 。由 于F Q s 药物同时也应用于人类多种感染性疾病的 治疗, 关于该药 物在临床应用时所产生的耐药性、 残留毒性以及不良 反应的 报道越来越多, 在食品 中 的 残留的 监测也引起 人们的重视。目 前, 对F Q s 药物残留的检测方法主要是色 谱法, 该方法的 前 处理 较复 杂, 专业技术要求
4、较高。 从近年来食品中 化学污 染物检测技术的发展趋势来看, 免疫分析 法是最有 前途的药残快速检测方法之一。原因 是 它以 抗原、 抗体之间特异性、 可 逆性结合反应为基 础, 灵敏度高、 特异性强、 操作简单, 不仅适用于大 量 样品a决速筛选, 某些情况下也可以用于确证 性检测m F Q , 是小分子物质, 属于 典型的半抗原, 它本 身不能诱导生物机体产生抗体,必 须将其与蛋白 质等大分子载体偶联, 形成人工合成的完全抗原, 进而 制备相应抗体13 1。 这也是建立免疫分析过程的 前提和关键所在。 针对各种药残建立免疫分析, 国 内外已有大量报道。但是关于完全抗原合成条件 及其对于偶联
5、效果和抗体性能的影响较少涉及。 而针对F Q s 类药物完全抗原合成过程的主要工艺 因素进行优化研究尚未见有报道。 采 用碳二亚胺法 合成恩诺沙星标准品( E F ) 完 全 抗原, 分别利 用紫外吸收 光谱和激光解析飞 行质 谱( M A I . D I - T O F - M S ) 对偶联物的 性质进行分析, 并以 抗血清效价为评价 指标, 采用正交 试验对 完全 抗原合成过程中的几个 主要因素进行了初步 优化。 收 稿 日期 墓 金项 目 作 者简 介 通 讯简 介 :2 0 0 5 - 0 8 - 2 6 :山东省科技攻关项 目( N o . 0 3 1 0 7 0 1 2 0 )
6、:隋建新, 男, 1 9 8 1 年出生, 硕士生 :林洪 1 材料与方法 1 . 1 材料和仪器 恩 诺沙星 标准品, 含量9 9 %, 中国 兽医 药品监 察所; N H S ( N - 经基墟拍酞胺) , S ig m a 公司; E D C ( 1 一 乙 基一 3 ( 3 一 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺 , S i g m a 公司; D C C ( 1 , 3 二环己 基碳二亚胺) , S i g m a 公司; a - 氰基一 径基肉 桂酸 ( a - c y a n o - 4 - h y d r o x y c i n - n a m i c a c i d , C H C
7、A ) , S ig m a 公司;弗氏完全佐剂 ( C F A ) , S i g m a 公司 沸 氏 不 完 全 佐剂 ( I F A ) , S ig m a 公司; 匙孔血蓝蛋白( I C L H ) , S i g m a 公司; 牛血清白 蛋白( B S A ) , 上海实生细胞生物技术有限公司; 人 血清白 蛋白( H S A ) , 北京经科宏大生物公司; 鸡血 清白蛋白( O V A ) , 北京经科宏大生物公司; 辣根酶 标记山羊抗小鼠I g G , 北京中山 生物技术有限 公 司; N .N , 一 二甲基甲I E M( D M F ) , 上海五联化工厂; T M B
8、 ( 3 , 3 , 5 , 5 一 四甲基对二氨基联苯二盐酸化 中 国 食品 学 报 2 0 0 6年第 1 期 物) , A m r e s c o ; 其它试剂均为分析 纯。 实验动物: B A L B / C 小鼠, 雌性, 6 - 8 周龄, 山 东大学医 学院动物房。 U V - 2 1 0 2 C分光光度计, U N I C O上海公司; M u L t i s k a n M K 3酶 标仪, 芬 兰L a b s y s t e m , 公司; A u to fl e x M M A L D I - T O F - M S 质谱仪( B r u k 。公司, 德国) 。 采用
9、从激光器, 波长3 3 7 n m , 正离子模式, 用 延 迟 引 出 ( D e l a y e d e x t r a c t i o n ) 的 线 性 检 测 方 式。 1 .2方 法 1 . 2 .1 制备免疫抗原和包被抗原110 采用碳二亚胺 法合成免疫抗原。 称取1 2 m g 恩诺沙星、 3 8 .4 m g N H S , 3 2 . 1 m g E D C 溶于2 5 0 V L D M F 中, 室温振 荡1 .5 h ; 3 0 0 0 r / m i n 离心3 0 s , 取上清 液5 0 W L , 加 人2 m L 含5 m g 载体 蛋白的P B S 溶液
10、( 预 先溶 有 3 3 % 的D M F ) , 室温振 荡1 5 h ; 3 0 0 0 r / m i n 离心3 0 s , 取上清液5 0 w L , 加人2 m l , 含B S A的P B S 溶液 ( 预先溶有3 3 %的D M F ) , 恒温振荡过夜 ( 1 1 0 r / m i n , 4 9 C ) ; 将反应物装人透析带中, 用含3 3 % D M F 的P B S 溶液透析,逐步减少P B S中D M F 的用量 至完全使用P B S , 透析完全后冻干, - 8 0 保存。 包被抗原的 合成采用K L H为载体蛋白, 其余 制ifr 步骤同免疫抗 原。 1 .
11、2 .2 正交试验表设计采用正交试验对偶联过 程中主要的工艺条件进行优化。除 实验所设计的 因素外, 其它条件及步骤同方法 1 .2 . 1 。 正交试验 表见表 t o 结合 比 = E F 质量浓度/ E F 相对分子质量 蛋白质量浓度1 蛋白相对分子质量 表1 正交试验设计 T a b l e 1 T h e d e s ig n o f t h e o r t h o g o n a l t e s t B_ 试 脸 号 ( 蛋白种类) n ( 恩诺沙星) : / n ( 蛋白) i ( 偶联时间爪) 1 B S A 2 5 : 1 8 2 HS A 7 5 : 1 1 6 3 OV
12、A 1 2 5: 1 2 4 注 二 物质 的量 m o l 1 .2 .3 利用紫外吸收光谱鉴定完全抗原分别 将E F以及透析后的偶联物稀释到一定浓度, 于 2 0 0 - 4 0 0 mm 紫外扫描。以 3 3 4 r a n 为 E F的特征 吸收峰, 建立吸收值一 浓度的标准曲线, 在此基础 上 测 定偶 联 物中E F 浓 度。 采 用L o w ry法 计 算出 偶联物中蛋白 质含量, 半抗原与蛋白质结合比的 计算公式为15 ) : 式中, E F 质量浓度 m g / - L ;蛋白质量浓度, m g / m L . 1 .2 .4 利用 M A L D I - T O F -
13、M S鉴定完全抗原基 体C H C A 用0 . 1 % T F A 一 乙 睛( 体积比3 : 7 ) 溶 液 配 成2 0 m 岁 m L 的溶液, 然后与蛋白 水溶液按1 : 1 比 例混合。取0 . 5 m L 混合溶液, 点在清洗干净的样 品 靶上, 冷风加速干燥后送人质谱仪分析。 半 抗原 与载体蛋白结合比的计算公式为: 结合比二( 偶联物相对分子质量一 蛋白 相对分 子 质量) / E f , 相对分子质量 1 .2 . 5 动物免疫61正交实验过程中抗血清的制 备是选用6 - 8 周龄的B A L B / C 小鼠为实验动物。 免疫前采血作为阴性血清。将3 0 0 E t g
14、完全抗原 ( 以蛋白浓度计)与0 . 0 5 m L生理盐水和0 .0 5 m L C F A混合后腹腔注射, 1 4 d 后第2 次免疫, 剂量与 方法同 第 1 次,将C F A换成I F A , 7 d 后采血测效 价。 3 5 d 时 进行第3 次免疫, 7 d 后摘眼球取血, 离 心取上清液, - 8 0 贮存备用。 1 .2 . 6 间 接E L I S A测定抗体的效价 方阵 滴定法 确定包 被抗原的浓度、 酶标二抗的稀释度及底物 浓度门 。 E L I S A操作程序: 包被: 用碳酸盐缓冲液 ( p H 9 .6 , 0 . 1 m o l / L ) 将包被抗原稀释到一定浓
15、度, 加到%孔酶标板上, 每孔1 0 0 p L L , 3 7 水浴温育 1 .5 h ; 洗涤: 用P B S T ( 0 . 1 %) 洗涤3次, 每次5 m i n , 弃去洗涤液, 用吸水纸将酶标板吸干; 封 闭 : 用。 . I % B S A ( O V A ) 封 闭, 每 孔2 0 0 匹, 3 7 水 浴温育 1 .5 h , 洗涤3 次后敲干; 抗原抗体反应: 将 一 定浓 度的 抗血 清 加到 板 孔中 , 每 孔1 0 0 IA, 3 7 水浴温育1 . 5 h , 洗涤3 次后吸干; 加人羊 抗鼠 酶标二抗, 每孔 1 0 0 泌, 3 7 水浴温育1 . 5 h
16、, 洗涤3 次后 吸干; 加 人T M B 底物 溶 液( 0 . 1 耐 M L ) , 每 孔1 0 0 N ,L , 3 7 水 浴 避 光温 育1 5 m i n ; ) 终止反应: 每孔加人5 0 p L L , 2 m o l / L 的 硫酸溶液终 止反应; 测定吸 光值。 空自板是以P B S 溶液代替 抗血清样品, 阴性 对照则使用小鼠免疫前采集的阴 性血清,其余操 作与实验样品一致。 抗血清的 效价定义为: 加人底 物, 3 7 反应1 5 m i n 后, 血清呈阳 性结果的最大稀 释倍数。 第 6卷第 1 期 恩诺沙星完全杭原的合成及其偶联条件的初步优化 结果 半抗原以
17、及完全抗原的紫外图谱特征 221 卜吕已廿已价卜 寸研寸r价1公价 50朋500 752 。乙赵卿世 A b s 30 0 0 2 . 5 0 0 2 . 0 0 0 1 . 5 0 0 1 . 0 0 . 5 0 0 住月 洲 旧 -0 . 5 0 0 划娜彭 2 0 0 _ 0 .2 5 0 . 0 3 0 0 . 0 扫 描 波 长jn m 3 5 0 . 0 4 1 旧 0 图1 恩诺沙星( A) , B S A( B) 及 E F - B S A偶联物( C) 的盆 外扫描图谱 F ig . 1 U V s p e c t co m o f e n m fl ma c i n ( A
18、) , n a ti v e B S A ( B ) a n d E F - B S A ( C ) 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 质荷比( m l. ) ( B) 图2 载 体蛋白(A ) 及偶联物旧】 的M A L D I- T O F - M S图 谱 F ig . 2 MA L D I - T O F m a s s s p e c tr a o f n a ti v e B S A ( A ) a n d E F - B S A( B ) 由图1 可以 看出, B S A 在2 8 0 n m处有特征吸 收
19、, E F 在3 3 4 n m处有特征吸收峰, 而两者的偶联 物在2 8 0 n m和3 3 4 n m处同时有特征吸收峰。 这是 由 于两 者吸收峰的 迭加效应, 使出现的2 个特殊吸 收 峰与E F 和蛋白纯品的吸收峰相比, 有一 定的位 移。 据 此可以初步判断, E F 已与 蛋白 发生偶联而成 为 完全 抗原。 相应的结合比计算 结果为1 9 .4 0 2 .2 完全抗原的MA L D I - T OF - MS分析 根据M A L D I - T O F - M S 图 谱( 见图2 ) , 可以清 晰地 判断出E F与B S A偶联形成了新的复合物, 该复 合物的 相对分子质量
20、约为7 5 9 4 1 。 对比B S A 的相 对分子质量( 6 6 4 2 8 ) 以 及E F 的相对分子质 量( 3 5 9 .4 0 ) , 可以较为准确地计算出E F 与B S A的 结合比 约为2 6 .4 。这一结果与紫外图谱的 结合比 计算结果有较显著的差异。 2 . 3 合成条件对于完全抗原偶联效果的影响 利用正交实验研究了完全抗原合成过程中主 要工艺参数对 偶联物免疫原性的影响, 并对其进 行了 初步优化, 结果见表2 。 其中每 组实验均设置 2 只 小鼠作为平行,最终取其抗血清效价的平均 值作为实验结果。利用E L I S A测定抗血清的效 价, 方阵滴定法确定包被抗
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 恩诺沙星 完全 抗原 合成 及其 条件 初步 优化
链接地址:https://www.31doc.com/p-3708894.html