抑胶素对大鼠脑胶质瘤细胞血管内皮生长因子作用的体内试验.pdf
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1、中风与神经疾病杂志2 0 0 6 年8 月第2 3 卷第4 期 41 3 文章编号: 1 0 0 3 - 2 7 5 4 ( 2 0 0 6 ) 0 4 - 0 4 1 3 - 0 3 抑胶素对大鼠脑胶质瘤细胞血管内皮生长因子 作用的体内试验 崔俐林卫红 , 孙艳梅“ , 徐丹“ 摘要: 目的研究抑胶素对大鼠脑胶质瘤血管内皮生长因子( V E G F ) 的影响。方法采用脑立体定向术, 在Wi s t a r 大鼠脑尾状核接种C 6 细胞, 应用免疫组织化学方法检测应用抑胶素前后对鼠脑胶质瘤血管内皮生长因 子的影响。结果经抑胶素治疗后可见肿瘤内血管内皮生长因子阳性细胞密度下降, 随浓度增加阳性
2、率呈下降趋 势。 实验组I ( 抑胶素浓度3 2 p g / k g ) 较对照组表达降低( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n I t s u g g e s t s t h a t t h e i n h i b i t i v e e f f e c t o f a n t i g l i o m a t i n o n t h e g r o w t h o f r a t b r a i n g l i o m a i s p r o b a b l y v i a d o w n - r e g u l a t i n g t h e V E G F
3、 e x p r e s s i o n . T h i s k i n d o f r e g u l a t i o n i s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e d r u g c o n c e n t r a t i o n . K e y w o r d s : A n t i g l i o m a t i n ; B r a i n g l i o m a ; V E G F 神经胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的一种, 因其 侵袭性生长的特性, 手术难以完全切除, 术后极易复 发 l 。 抑胶素作为一种特异性氯
4、离子通道阻滞剂, 是 一种蝎毒素多肤, 其有效成分氯毒素能与神经胶质 瘤细胞表面异常表达的氯离子通道特异性结合, 对 胶质瘤细胞有显著的抑制作用 2 1 。近年国外对氯毒 素的研究较多, 国内未见氯毒素类物质对C 6 胶质瘤 作用的研究报道。我们在体内试验中观察了抑胶素 对胶质瘤细胞血管内皮生长因子的影响, 结果如下。 1 材料与方法 1 . 1 细胞株和动物分组大鼠C 6 脑胶质瘤细 胞株是由雄性大鼠经静脉注射硝甲基脉而诱发产生 的恶性胶质瘤细胞株 3 。本实验所用的瘤株是由吉 林大学病理毒理学教研室提供。抑胶素是由吉林大 学基础医学院生理教研室提供; 顺铂( C D D P ) , 1 0
5、 m g / 每支, 购自山东齐鲁制药厂。动物选用雄性、 健康Wi s t a r 大鼠6 0 只, 鼠龄6 -8 周, 体重2 0 0 g 2 5 0 g , 由吉林省高新技术开发区动物中心提供。 1 . 2 实验动物分组将全部Wi s t a r 大鼠随机 分为6 组, 每组1 0 只。 于细胞接种后第7 天开始给予 药物治疗。具体如下: ( 1 ) 空白对照组: 0 . 9 0 o N a C l ; 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 2 - 1 6 ; 修订日 期: 2 0 0 6 - 0 7 - 0 5 基金项目: 2 0 0 3 年吉林省卫生厅医学科研基金( 2 0 0 3 -
6、 0 3 2 3 ) 作者单位: ( 1 . 吉林大学第一医院神经内科, 吉林 长春 1 3 0 0 2 1 ; 2 . 沈 阳军区8 1 疗养院, 辽宁 沈阳 1 2 5 1 0 5 ; 3 . 长春大学医院. 吉林 长春 1 3 0 0 0 0 ) J A p o p l e x y a n d N e r v o u s D i s e a s e s , A u g u s t 2 0 0 6 , V o l 2 3 , N o . 4 明显。 2 . 2 V E G F免疫组化结果分析V E G F阳性 细胞的胞核呈黄色或棕黄色, 镜下计数肿瘤内5 个 视野的阳性细胞。对照组肿瘤细胞
7、中V E G F阳性表 达率( V E G F指数) 平均为7 6 - 0 7 % 0 , 表现为阳性细胞 密度高, 胞核呈强阳性, 数量多。经抑胶素治疗后即 可见肿瘤内V E G F阳性细胞密度下降, 核V E G F阳 性强度减弱, 随浓度增加阳性率呈下降趋势。 实验组 1Q 较对照组表达降低( P 0 . 0 5 )见表1 ) o 表1 抑胶素治疗组、 顺铂组与对照组大鼠脑 V E G F指数的变化( x 士、 ) 浓度例数V E G F指数( %) T值 亡JJ”1 110 76.72. ( 2 ) 抑胶素不同浓度组: ( I : 8 t .g / k g ; II : 1 6 u g
8、 / k g ; III : 3 2 f .c g / k g ; N : 6 4 K g / k g ) ; ( 3 ) 顺铂组: 5 0 t .g / k g , 一 周两次, 腹腔注射用药。 1 . 3 细胞培养将C 6 大鼠脑胶质瘤细胞株复 苏成功后, 接种于2 5 c m“ 培养瓶中。 将复苏后的C 6 胶 质瘤细胞加人含1 0 %灭活小牛血清的I MD M培养液 中, 置于含5 0 o C 0 2 , 3 7 C 恒温密闭式孵箱中培养, 每 周传代两次。 当细胞增殖进人对数阶段, 用0 . 2 5 %胰 酶溶于磷酸盐缓冲液中消化细胞, 在显微镜下观察 到细胞开始皱缩时加人营养液中和
9、, 反复吹打, 使之 脱壁, 1 0 0 0 r / m i n离心 5 m i n , 弃上清, 制成细胞悬 液 4 。 体外培养的C 6 胶质瘤细胞爬片常规应用免疫 组化( S A B C法) 检测G F A P蛋白的表达, 阳性细胞 呈现胞浆棕黄色着染。 1 . 4 接种方法收集对数生长期生长状态良 好的C 6 细胞, 细胞浓度为2 . 0 X 1 0 6 / 1 0 川, 均采用立 体定向方法进行接种。根据B a r k e r 法确定切口和钻 孔位置阁, 在大鼠脑立体定位仪上选取大鼠脑右侧 尾状核区为靶点, 经1 0 %水合氯醛腹腔注射麻醉后, 在颅骨上钻孔, 孔径1 . 2 m m
10、, 用微量注射器在立体定 向引导下接种于硬膜下5 . O m m靶点处, 将1 0 闪细胞 悬液以1 川 / m i n 缓慢注人靶区, 留针5 m i n , 使细胞充 分沉积, 缝合头皮。每只大白鼠每天给予青霉素1 0 万单位腹腔注射, 共5 d以预防感染。 1 . 5 免疫组化法检测血管内皮生长因子采 用 S A B C法, 石蜡切片脱蜡, 3 %双氧水阻断1 O m i n , 微波修复抗原l O m i n e 1 0 %山羊血清封闭非特异性抗 原室温下6 0 m i n 。 弃去血清, 加1: 1 0 0 稀释的V E G F , 置湿盒内4 C过夜。P B S冲洗5 m i n
11、X 3 次, 滴加生物 素化二抗工作液, 加盖湿盒内室温下6 0 m i n a P B S 振 洗5 mi n X 3 次。加人S A B C复合物, 室温下6 0 m i n , P B S 振洗5 m i n X 4 次。 D A B显色液显色。 苏木素衬 染3 m i n 。 自 来水冲洗, 酒精水化, 二甲苯透明, 中性树 胶封片。 正常脑组织为正常对照, 结果以胞核或( 和) 胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。 1 . 6 统计分析方法采用S P S S统计分析软 件, 各组观察指标均用X 士: 表示, 然后进行t 或t 检 验。 2 结果 2 . 1 鼠脑胶质瘤的形态学观察对照组均可
12、见到较大的胶质瘤, 肿瘤呈不规则形, 边界较清晰, 瘤内可见出血和坏死。实验组 I 肿瘤与对照组大小 差别不明显; 实验组 亚 的肿瘤略有变小, 少数有出血 和坏死; 实验组 班和w的肿瘤明显变小, 边界不清, 仅有少量出血和坏死; 顺铂组的肿瘤体积缩小亦较 对照组 实验组 I 实验组 a 实验组 1 实验组N 顺铂组 8 t L g / k g 1 6 p g / k g 3 2 p g / k g 6 4 p g / k g 5 0 p g / k g 8 / 1 0 8 / 1 0 9 / 1 0 1 0 1 0 9 / 1 0 0 7 士1 1 . 8 1 士1 2 . 7 4 士 1
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