抗人轮状病毒IGY的制备.pdf
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1、1 0 8江苏农业科学2 0 0 6 年第2 期 抗人轮状病毒I g Y的制备 查恩辉 , 岳喜庆, , 刘长江 2 , 皮玉 珍2 ( 沈阳农业大学食品学院, 辽宁沈阳1 1 0 1 6 1 ) 摘要: 利用能引起婴儿腹泻的轮状病毒制备灭活疫苗, 免疫产蛋母鸡, 并用E L I S A 法检测抗体活性。 结果表 明: 母鸡在免疫后第1 1 d 卵黄中出现特异性抗体, 加强免疫后抗体活性迅速升高, 免疫3 5 - 4 2 d 达到高水平, 3 次免疫后活性较长时间不下降。 经硫酸钱两步沉淀法从鸡卵黄中分离抗人轮状病毒卵黄免疫球蛋白( 抗H R V - I g Y ) , 透析纯化I g Y 测
2、得抗体蛋白 含量达1 4 m g / m l 蛋黄液。 关键词: 母鸡; 卵黄免疫球蛋白; 人轮状病毒; 酶联免疫吸附 中图分类号: 8 5 1 2 . 5文献标识码: A文章编号: 1 0 0 2 一 1 3 0 2 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 0 8 - 0 2 人轮状病毒( H u m a n R o t a v i r u s , H R V ) 是引起婴 儿腹泻的主要病因, 世界每年有大约9 0 万人死于该 病。在我国, 每年5 岁以下小儿腹泻病患者达2 . 5 亿人次, 其中相当比 例是由轮状病毒引起的, 由 此可 见 其危害 性 极大 。 对由 人轮状病毒引 起的
3、 腹泻, 目 前在治疗上除采用口 服或静脉注射补液纠正脱水 之 外 , 对于 发 病者尚 无特效药 2 1 。 近年来的 研究发 现, 当用抗原免疫产卵母鸡后, 鸡可产生相应的抗体 并转移和积累于卵黄中, 此抗体被称为卵黄免疫球 蛋白( I m m u n o g l o b u l i n o f Y o l k I 简称I g Y ) , 与哺乳动 物抗体I g G相比, I g Y具有许多特点, 如产量大、 均 一性好, 不激活哺乳动物补体系统, 不非特异性结合 类风湿因子, 不固定葡萄球菌 A蛋白, 不与哺乳动 物 免 疫球 蛋白 之间 发生交叉血清型反应等 3 - 7 ; 将 它作为
4、食品添加剂添加到食品中可以增强人体免疫 力。本试验以能引起婴儿腹泻的人轮状病毒 一 W a 株为抗原, 研究它在鸡体上的免疫应答并分离抗 H R V的卵黄免疫球蛋白( 抗 H R V一 I g Y ) o 1 材料与方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 人一 W a 株轮状病毒毒种购自中国科学 院北京病毒研究所。 1 . 1 . 2 M a r k 1 4 5 细胞东北农业大学动物医学学 院预防医学教研室惠赠。 收稿日 期: 2 0 0 5 一 1 1 一 1 8 基金项目: 辽宁省动物性食品研究重点实验室基金项目。 作者简介: 查恩辉( 1 9 7 9 -) , 女, 辽宁葫芦岛市人,
5、 在读硕士研究生, 主要从事食品生物技术研究。T e l : ( 0 2 4 ) 8 8 4 9 0 7 0 0 ( 实验室) ; E一 m a i l : M i c h e l l e - e n h u i 1 2 6 . c o mo 1 . 1 . 3 母鸡 鞍山大丰生物有限公司养鸡场提供。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 M a r k 1 4 5 细胞的复苏与传代培养取出冻 存的M a r k 1 4 5 细胞放在3 7 水浴中 融化, 取出细胞 悬液注人离心管, 并加1 0 倍体积的1 6 4 0 维持液后 按1 0 0 0 r / m i n 离心8 m i n , 弃
6、去 1 6 4 0维持液, 加 1 6 4 0 培养液后接种至细胞瓶, 在3 7 t , 5 % C O , 培 养箱中静置培养, 密度高时传代。 1 . 2 . 2 人一 W a 株轮状病毒的增殖传代培养的 M a r k 1 4 5 细胞长满单层后接种人一 W a 株轮状病毒, 接种前的 轮状病毒用2 0 R g / m l 的 胰蛋白 酶按1 : 1 混匀, 3 7 吸附1 h 。 取2 m l 病毒胰蛋白 酶混合液 接种于用 P B S洗 3 遍的M a r k 1 4 5单层细胞, 在3 7 T , 5 % C O : 培养箱中静置吸附4 0 m i n 。加1 6 4 0 维 持液
7、, 放在3 7 1C , 5 % C O : 培养箱中静置培养, 每天 观察病变, 如没有 C E P变化则按上述方法继代培 样。若有C E P 变化, 当C E P 达到8 0 %以上时收毒。 1 . 2 . 3 病毒感染力的 测定 R e e d 一 M u e n c h 法 8 1 测定。 1 . 2 . 4 病毒的灭活向浓缩后的病毒细胞液中加 终浓度为0 . 3 %福尔马林溶液, 3 7 灭活4 8 h , 每隔 6h 振荡 1 次。 1 . 2 . 5 免疫原的制备9 4 %液体石蜡与 6 % S p a n 8 0 混合液加2 %的硬脂酸铝( 氢氧化铝) 作为 油相, 1 2 1
8、 灭菌2 0 m i n , 4保存备用。将灭活后 的H R V细胞液与配制好的油相以1: 3 混合, 均质 1 h 后在胶体磨中 快速乳化成油包水型疫苗。 1 . 2 . 6 蛋鸡免疫 对1 2 0日 龄母鸡免疫。 将蛋鸡分 为2 组: 一组作为对照组; 另一组为试验组, 对试验组 的每只鸡进行胸肌多点注射0 . 5 n il 免疫原, 初免后 查恩辉等: 抗人轮状病毒I g Y的制备 1 0 9 两周进行二免, 方法同 初免, 免疫剂量增加至l . 0 m l , 二免两周后进行三免, 免疫剂量增加至1 . 5 m l o 1 . 2 . 7 抗体检测阳性结果的判断采用竞争 E L I S
9、 A阳性判定值法进行。 1 . 2 . 8 卵黄抗体活性检测1 0 d 后开始收集鸡蛋, 应用E L I S A法检测卵黄抗体活性。 1 . 2 . 9 卵黄抗体的制备无菌收集卵黄, 去离子水 6 倍稀释过夜, 9 0 0 0 r / m i n 离心 1 5 m i n , 取上清液, 分别加人6 0 %和3 3 %饱和度的硫酸钱两步沉淀, 最 后溶于原卵黄量等体积的P B S 中, 4 透析2 4 h , 即 为 提 纯 卵 黄 抗 体, 在 蛋白 液中 加0 . 1 % N a N 。 于4 保存。 1 . 2 . 1 0 I g Y抗体蛋白 含量的测定 采用2 6 0 n m - 2
10、8 0 n m双波长测定提取物中的蛋白含量。 二 对照组 试验组 100806040.2 恻孽00 0 1 1 1 3 从图2 可看出 2 1 2 8 3 5 4 2 4 9 5 6 6 3 时间( d ) 抗H R V - I g Y 活性变化 , 在注射疫苗的第 1 1 d 检测到抗 2 结果与讨论 2 . 1 特异性I 叮 定性检刚结果 从初免的第 2 d开始收集鸡蛋, 采用竞争 E L I S A法对抗体进行定性检测, 并用阳性判定值法 判断, 结果见表1 。 表 1 阳性判定结果 O D 4 1 。 值 H R V的 活性。初免后的第二周加强免疫, 加强免疫 后的一周抗体活性有大幅度
11、的提高, 第三次免疫后的 一周活性继续提高, 并维持在此水平相当长的时间。 2 , 3 免疫注射对蛋鸡产蛋率的影响 给蛋鸡免疫产生的应激反应对蛋鸡的生理活动 和生理机能都会产生一定的影响。本试验中, 母鸡 的产蛋率由免疫前的8 6 %突降到注射后第 I d的 5 9 %, 至第7d 才恢复到原来的水平。对照组虽然 没有免疫, 但是可能由于受到环境的影响以及免疫 其他蛋鸡时而受到惊吓, 所以产蛋率也同步下降, 但 到第5 d 基本恢复正常。因此, 免疫注射对蛋鸡产 蛋率的影响还是非常小的。 项 目 1111 1 . 0 2 5 1 . 0 3 7 1 . 0 2 8 平均值 9080706050
12、40302D 水哥咧代 I II1 阴性 阳性 0 . 6 3 00 . 71 0 0 . 6 4 0 1 . 0 3 0 0 . 6 6 0 丈矛 丫 声 尸 + 对照组 . 试验组 J7 二了0 J13 -L4 儿八j 上, 00 飞1 阳 性判定值二 0 . 4 N C x + 0 . 6 P C x 二 0 . 8 0 8 , O D 4 s o 0 . 8 0 8 为阳 性。 从图1 可以看出, 第1 0 d 之前的抗体O D , 。 值 都大于阳性判定值0 . 8 0 8 , 免疫后的第 1 1 d 在卵黄 中 得到的 抗体O D , , 。 值为0 . 7 9 2 0 . 8 0
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- 轮状病毒 IGY 制备
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