天然内生抗菌多肽ELAFIN真核表达载体的构建及在真核细胞的表达.pdf
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1、.6 0 8 中国抗生素杂志2 0 0 5 年 1 0 月第 3 0 卷第 1 0 期 文章编号: 1 0 0 1 - 8 6 8 9 ( 2 0 0 5 ) 1 0 - 0 6 0 8 - 0 3 天然内生抗菌多肤e l a f i n真核表达载体的构建及在真核细胞的表达 杨捷周向东 ( 重庆医科大学附属第二临床医院, 重庆4 0 0 0 1 0 ) 摘要: 采用R T - P C R法提取天然内生抗菌多肤e l a f i n的基因, 通过测序确认后亚克隆构建真核表达载体p E G F P - N 1 - e l a f i n , 再转染至肺上皮细胞 A 5 4 9 , 荧光显微镜观察p
2、 E G F P - N 1 - e l a f i n 在细胞中表达及定位, 采用N o r t h e r n杂交、 E L I S A检测法分别从转 录及蛋白质水平分析表达情况, 最后通过酶切电泳鉴定证实真核表达载体p E G F P - N 1 - e l a f in 构建成功, 其转染细胞中有e l a f i n 的基 因表达, 且细胞上清液中e l a f i n含量证实其主要是分泌性表达。 E l a f i n 基因c D N A真核表达载体的成功构建以及主要呈分泌性表达 的特点显示了极具意义的潜在应用价值。 关键词: E l a f i n ; 中图分类号: R 9 6
3、9 真核表达载体; 抗菌多肤 文献标识码 : A C o n s t r u c t i o n o f n a t u r a l a n t i b a c t e r i a l e n d o - p o l y p e p t i d e e l a f i n s e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r a n d i t se x p r e s s i o n i n e u k a r y o t i c c e l l Y a n g J i e a n d Z h o u X i a n g - d o n
4、g ( T h e S e c o n d A f f i l ia t e d H o s p i t a l , C h o n g q i n g U n i v e r s i t y o f Me d i c a l S c i e n c e s , C h o n g q i n g 4 0 0 0 1 0 ) A B S T R A C T Ob j e c t i v e T o c o n s t r u c t n a t u r a l a n t i b a c t e r i a l e n d o - p o l y p e p t i d e e l a f i
5、 n s e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r ,a n d o b s e r v e i t se x p r e s s i o n t o p u l m o n a r y e p i t h e l i a l c e l l . Me t h o d s T o t a l R N A w a s e x t r a c t e d f r o m i n f e c t e d l u n gt i s s u e s,a n d e l a f i n c D NA w a s o b t a i n e d
6、b y R T - P C R . I t s s e q u e n c ew as c onsi s t ent wi t h t h a t o f e l a f i n p r o v i d e d b y G e n B a n k o n m o n a r y e i t h e l i a l c e l l A5 4 9 . T h e I nt e r net . p E G F P - N1 - e l a f i n w a sc o n s t r u c t e d,a n d t h e n t r a n s f e c t e di nt o t r a
7、n s c r i p t i o na n d s e c r e t i o n o f e l a f i nw ereo b s e r v e b y f l u o r e s c e n c e mi c r o s c o p e a n d a n a l y z e d b y N o r t h e r n b l o t t i n g a n d E L I S A . R e s u l t s C o n s t r u c t i o n o f p E G F P - N 1 - e l a f i n e l a f i n g e n e c o u l
8、d b e e x p r e s s e d i n t h e t r a n s f e c t e d c e l l s m a i n l y i n s e c r e t i o n f o r m. C o n c l u s i o n i s s u c c e s s f u l , a n d T h e e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n m a i n l y b y m a t r on. v e c t o r o f e l a f i n h a s b e e n c o n s t r u c t e d ,
9、 a n d t h e r e i s s o me e v i d e n c e t h a t t h ee xpr e s s i o no f e l a f i n e a r l y s ec r et i on i n A5 4 9 w h i c h s h o w e d t h e p o t e n c y o f e l a f i n i n t h e t r e a t me n t o f c h r o n i ca i r w a y g e n e i s i n f l a m- K E Y WO R D S E l a f i n ; E u k
10、a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r ;A n t i b a c t e r i a l p o l y p e p t i d e 气道中被激活的多形核细胞( P MN) 释放粒细胞 弹力酶( H N E ) 是引起慢性气道炎症性疾病如慢性阻 塞性肺疾病( C O P D ) 、 哮喘等的炎症级联反应的终效 应因子P 7 。近年国外的研究表明主要由肺组织构成细 胞在炎性刺激诱导下表达的内源性抗损伤因子e l a f i n 作为一种特异性弹力酶抑制剂和天然抗菌剂起着关键 作用 2 ) 。 鉴于e l a f i n 抗菌和抗炎性损伤双重作
11、用的独 特优势, 本实验构建e l a f i n 真核表达载体, 并观察其转 染肺上皮细胞后的表达情况, 为研究e l a f i n 作为天然 抗菌多肤的应用提供技术基础。 1 材料与方法 1 . 1 材料 细胞裂解液、 D E P C 、 地高辛标记试剂盒购 自 R o c h e 公司; MML V( 重组鼠白血病毒逆转录酶) 第一 链合成试剂盒购于上海生工生物工程公司; 限制性内 切酶、 T , D N A连接酶购于大连宝生物公司; 少量胶回 收试剂盒、 少量质粒抽提试剂盒购于上海华舜生物公 司; 阳离子脂质体转染试剂盒T F X - 2 0 ( P r o m e g a 公 收稿
12、日期: 2 0 0 4 - 1 0 - 2 2修回日期: 2 0 0 5 - 0 6 - 2 2 作者简介: 杨捷, 女. 生于1 9 7 8 年, 在读博士研究生。研究方向: 慢性气道炎症枯液高分泌发生机制., 通讯作者, E - m a il : 7 , X D 9 9 9 2 6 3 . n e t 天然内生抗菌多肤e l a f i n真核表达载体的构建及在真核细胞的表达杨捷等 .6 0 9 司) ; D N A分子量标准( Ma r k e r ) 购于北京鼎国生物公 司; E L I S A试剂盒购于北京中山生物技术公司。克隆 载体p U C m - T ( 上海生工生物工程公司)
13、 ; 绿色荧光蛋 白真核表达载体 p E G F P - N1 , 由第三军医大免疫研究 所万瑛博士馈赠, 插人其多克隆位点E c o R工 和B a m H I 两酶切位点间; 该载体含卡那霉素抗性基因。 E . c o l i D H5 a 株系免疫研究所保存。 肺上皮细胞株A 5 4 9由重 庆医科大学病理教研室保存, 常规复苏后生长于加人 1 0 %胎牛血清、 1 %一 谷氨酞胺及 1 %青霉素和链霉素 的D ME M ( D u l b e c c o E a g l e s 最低必需培养液美国 G i b c o / B R L公司) , 置 3 7 0C, 5 o o C O :
14、 的孵箱中孵育。 1 . 2 目的基因的克隆 将提取的肺组织总R N A按 MML V第一链合成 试剂盒说明书操作合成e l a f i n第一条链; 根据 G e n - B a n k 提供序列( 6 7 - 4 2 0 ) , 应用P r i m e r P r e m i e r 5 . 0 软件 设计上、 下游引物 上游引物: 5 - C G全鱼工 工 旦 A T - G A G G G C C A G C A G C T T C T T G - 3 ( 下划线处为 E c o R I 酶切位点处, A T G为p E G F P - N 1 的序列在真核细 胞 中表达所必需的翻译启
15、动码) ; 下游引物: 5 - C G G G A T C C T C A C T G G G G A A C G A A A C A G G - 3 ( 下划 线处为B a m H I 酶切位点处) , 扩增片段 3 7 7 b p , 引物 由上海 G e n e b a s e 生物公司合成。P C R反应条件为: 5 0 1 1 反应体系中引物终浓度 l O p m o l , 1 O m m o l / L d N T P 4 u 1 , Mg C I Z ( 2 5 m m o l / L ) 4 1 1 , 1 O X P C R缓冲液 5 1 1 , T a g D N A合成
16、酶( 5 U 扣D O . 5 1 1 , 取反转录反应体 系 2 川加人 P C R反应体系中, 轻轻混匀。9 4 变性 4 5 s , 6 1 退火 4 5 s , 7 2 延伸 l m i n , 3 0个循环, 最后 7 2 总延伸l 0 m i n , 扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果。 1 . 3 真核表达载体p E G F P - N l - e l a f i n构建及鉴定 将P C R产物纯化后, 采用E c o R I , B a m H I 双酶 切克隆到p U C m - T, 通过转化筛选、 质粒扩增抽提纯 化, 测序。 将目的基因片段定向亚克隆到绿
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