新生大鼠缺氧缺血性脑损伤AQP-4表达及依达拉奉治疗效果的研究.pdf
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1、专家论坛2 0 1 0 年3 月第1 7 卷第7 期 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤A Q P - 4 表达 及依达拉奉治疗效果的研究 夏莉,阴谅清,阴崇娟,武师润,常霞,张素芬 ( 山西医科大学第一医院儿科,山西太原0 3 0 0 0 1 ) 【摘要】目的:探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤( h y p o x i c i s c h e m i eb r a i nd a m a g e ,H I B D ) 后脑组织水通道蛋 刍- - 4 ( A Q P 一 4 ) 的表达变化及依达拉奉( e d a r a v o n e ) 对其治疗效果的影响。方法:将7 日龄W i s t a r 大鼠1
2、2 0 只随机分为3 组:假手 术组、缺氧缺血模型组( H I B D 组) 及依达拉奉治疗组,每组各4 0 只。每组根据处死的时间不同又分5 个亚组:6 、2 4 h 、3 、5 、7d 组,每亚组各8 只,各组分别于不同时间点处死动物,测脑组织含水量,并采用免疫组化方法检测A Q P - 4 的表达。结果:A Q P o 在缺氧缺血6h 即增强,3d 达高峰,5 7d 逐渐降低( P 0 0 1 ) ;治疗组各时间点A Q P - - 4 表达水 平较H I B D 组明显降低( P 0 0 1 ) 。结论:A Q P - 4 参与了H I B D 脑水肿的发生发展过程。依达拉奉可降低A
3、Q P - - 4 的表 达,从而减轻脑水肿,这可能是其脑保护作用机制之一。 【关键词】依达拉奉;水通道蛋白4 ;新生大鼠;缺氧缺血;脑水肿 【中图分类号】R 一3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 4 一- 4 7 2 1 ( 2 0 1 0 ) 0 3 ( a ) 一0 0 4 0 3 E x p r e s s i o no fA O P _ 4 a n de f f e c t so fe d a r a v o n ei nn e o n a t a lr a t sw i t hh y p o x i c i s c h e m i cb r a i nd a m a g
4、e X AL i , Y mH u a i q i n g , Y I NC h o n g u a n , W US h i r u n , C H A N GX 虹Z H A N G 跏,l ( D e p a r t m e n to fP e d i a t r i c s 。F i r s tH o s p i t a lo fS h a n x iM e d i c a lU n i v e r s i t y , T a i y u a n0 3 0 0 0 l ,C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e :T op r o b
5、ei n t ot h ee x p r e s s i o no fA Q P - 4i nb r a i nt i s s u ea f t e rh y p o x i e - i s c h e m i cb r a i nd a m a g e 呷I B D ) i nn e o n a t a lr a t aa n dt h ee f f e c to fE d a r a v o n eo nt h e t r e a t m e n to fH I B D M e t h o d s :At o t a lo f1 2 0s e v e n - d a y - o l dW
6、i s t a rr a t s w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ( n - - 4 0 ) ,s h a m - - o p e r a t e dg r o u p ,h y p o x i e - i s c h e m i eb r a i nd a m a g e ( H I B D ) g r o u pa n d E d a r a v o n e - t r e a t e dg r o u p E a c hg r o u pw e r ed i v i d e di n t o f
7、 i v es u b g r o u p s 仉= 8i ne a c hs u b g r o u p ) b a s e do nd i f f e r e n tt i m e p o i n t sa f t e rH I B D ( 6 ,2 4h ,3 ,5 , 7d ) A n i m a l sw e r es a e r i i l c e da td i f f e r e n tt i m ep o i n t s C h a n g e so fb r a i nw a t e rc o n t e n tw e r e d e t e r m i n e d A n
8、 di m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u eW a su s e dt od e t e r m i n et h ee x p r e s s i o no fA Q P - 4 R e s u l t s :T h ee x p r e s s i o n o fA Q P - - 4i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yo n6ha f t e rH I B D , t h ep e a l 【r e a c h e do n3da n d5 - 7ds r a d 岫U y
9、d e c r e a s e d ( P O 0 1 ) T h el e v e lo fA Q P - 4e x p r e s s i o ni nt r e a t m e n tg r o u pW a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nH I B Dg r o u pa te a c ht i m ep o i n t 但, o 0 1 ) C o n c l u - d o n :A Q P - 4i n v o l v e si nt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n
10、 tp r o c e s so fc e r e b r a le d e m aa f t e rH I B D E d a r a v o n ec a nr e d u c e t h ee x p r e s s i o no fA Q P - - 4 ,8 0a st oa l l e v i a t eb r a i ne d e m a , w h i c hm a yb et h eo n eo ft h em e c h a n i s m so fb r a i np r o t e c t i o n 【K e yw o r d s lE d a r a v o n e
11、 ;A q u a p o r i n - 4 ;N e o n a t a lr a t s ;H y p o x i c - i s c h e m i c ;B r a i ne d e m a 新生儿缺氧缺血性脑病( h y p o x i c i s c h e m i ee n e e p h a l o p a - t h y ,H I E ) 是由于各种围生期窒息导致胎儿或新生儿脑缺氧 缺血性损伤,而脑水肿是新生儿H I E 早期出现的病理生理 过程,与许多后遗症的发生密切相关。近年来人们发现水通 道蛋白4 ( A Q P - - 4 ) 与脑水肿的形成关系密切,而且在缺氧缺
12、血的脑组织中A Q P - 4 表达显著增高【l 】。研究表明,脑缺血所 致水肿及组织损伤的机制与氧自由基的大量产生有密切关 系。依达拉奉是一种具有捕获羟自由基的活性抗氧化剂,可 抑制脑组织( 血管内皮细胞,神经细胞) 的过氧化作用t 2 l ,目前 已证实依达拉奉对缺血性脑损害具有明显的保护作用 3 - 4 t 。有 研究提示它理论上可用于新生儿H I E 的治疗四,但国内、外 尚无明确报道。 本实验通过研究依达拉奉对新生大鼠缺氧缺血性脑损 陲金项目】山西省太原市科技局科技兴市基金资助项目( 项目编号:0 7 0 5 0 2 6 ) 。 通讯作者:阴怀清。教授,山西医科大学第一医院儿科主任,
13、邮编:0 3 0 0 0 1 。 【作者简介1 夏莉0 9 s 4 - ) ,女,山西医科大学在读硕士。 圣巾周当代医蕊C H l 纣A 旧明州蜒D 嘲峨) 伤后A Q P - - 4 表达及脑含水量的影响,进一步探讨其对新生 大鼠H I B D 的保护作用及其可能的保护机制,为其在新生儿 H I E 的临床运用提供理论依据。 1 材料与方法 1 1 试剂与药品 水通道蛋白- 4 ( A Q P _ 4 ) 兔抗鼠多克隆抗体及S P 系列试 剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司,依达拉奉注射液 ( 商品名:易达生,2 0m l :3 0m g ) 由吉林省博大制药有限责任 公司提供。 1 2
14、动物分组及动物实验 清洁级,封闭群,新生7 日龄W i s t m 大鼠1 2 0 只。体重 1 2 一1 6g ,雌雄不限( 由山西医科大学动物实验中心提供) ,随 机分为假手术组、H I B D 组及依达拉奉治疗组,每组各4 0 只。 根据处死时间不同各组又分5 个亚组:6 、2 4h 、3 、5 、7d 组。 每组8 只。H I B D 组和治疗组参照R i c e 等阍的方法。取颈部正 中切口,分离左侧颈总动脉并双结扎,术后恢复2h 置于 万方数据 2 0 1 0 年3 月第1 7 卷第7 期专家论坛 3 7 恒温水浴密闭容器中,给以8 0 2 + 9 2 N 22h ,制成 H I
15、B D 模型。假手术组仅分离左侧颈总动脉但不结扎且不予 低氧处理。治疗组于H I B D 后即刻给予腹腔注射生理盐水稀 释的依达拉奉注射液,剂量2m g k g ,每2 4 小时1 次,连续5d 。 1 3 标本的制备 各组分别于术后不同时间点断头取脑组织1 0 多聚甲 醛室温固定2 4h 后沿视交叉和其后4r l l l n 处冠切( 包括完整 的海马区) ,做石蜡包块,连续冠状切片,行相关检测。 1 4 脑组织含水量的测定 将各时间点脑组织分别置于电子天平称湿重( 精确到 0 1I n g ) ,然后置于1 0 0 。C 恒温烘箱2 4h 称干重。按E l l i o t 公 式,含水量=
16、 ( 湿重一干重) ,湿重1 0 0 。 1 5H E 染色 常规石蜡切片一二甲苯脱蜡一梯度酒精脱水一苏木素。伊 红染色一二甲苯透明一中性树胶封片一显微镜下观察。 1 6 免疫组化 切片常规脱蜡至水,3 H 2 0 :室温孵育1 5m i n ;枸橼酸缓 冲液中抗原修复2m i n ;滴加封闭用正常山羊血清工作液室 温中孵育2 0m i n ;滴加一抗A Q P - 4 ( 1 :2 0 0 ) ,湿盒置于4 冰 箱中过夜,P B S 液洗2m i n 次x 3 次;滴加生物素化二抗。室温 下孵育1 5m i n ,P B S 液洗2m i n 次3 次;滴加辣根酶标记链 霉卵白素工作液( S
17、 - - A H R P ) ,室温下孵育1 5m i n ,P B S 液洗2 m i n 次3 次;用D A B 显色剂显色( 镜下观察显色程度) ,自来 水终止;苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照切 片用P B S 液代替一抗,余步骤相同。 1 7 图像分析 采用B I 一2 0 0 0 医学图像分析系统( 成都泰盟科技有限公 司) 进行图像采集与分析,在相同光亮强度和放大倍数( 1 0 x 4 0 ) 条件下统计阳性细胞平均灰度值,每只鼠3 张片子,每张 片子取4 个视野,算出其均数进行比较与分析。 1 8 统计学分析 数据以孟- - t :s 表示,用S P s S l
18、3 0 统计软件进行单因素方差分 析,两两比较采用S N K _ q 检验,P 0 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 脑组织含水量结果 H I B D 组脑组织含水量在术后6h 开始升高( 尸:( 0 0 5 ) ,3d 达高峰。治疗组各时间点与H I B D 组比较。差异有统计学意 义( P O 0 1 ) 。结果见表1 。 衷13 组大不同时闻点脑组织舍水的变化( 牙蜘。) 组别6 h 2 4h 3d5d 7 d 假手术组6 4 6 0 x O 9 96 5 0 2 + 1 4 26 5 3 7 1 3 06 4 9 8 + 1 2 96 5 2 4 士- 0 9 5 m B
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