小鼠MIP1α真核表达质粒的构建及在HSVⅡ核酸疫苗中的应用.pdf
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1、2 8 6I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 坦 论著 文章编号: 1 0 0 7一 8 7 3 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3一 0 2 8 6一 0 4 小鼠MI P - 1 。真核表达质粒的构建及在 H S V - I I 核酸疫苗中的应用 邵文爱 , 李晓眠 2 ( 汕 头 大 学医 学院 微 生 物 与 免 疫 学 教 研 室, 广 东汕 头5 1 5 0 3 1 ; 天 津 医 科 大 学 微 生 物 学 教 研 室, 天 津3 0
2、 0 0 7 0 ) C o n s t r u c t i o n o f r e c o mb i n a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d o f m u r i n e c h e m o - k i n e MI P - 1 ot a n d c o i mmu n i z a t i o n wi t h HS V- I I DNA v a c c i n e S H A O W e n - a i , “X i a o - m i a n 2 D e p a r tm e n t o f M i c
3、r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y , S h a n t o u U n i v e r s i t y M e d i c a l C o l l e g e , S h a n t o u 5 1 5 0 3 1 ; 2 D e p a r t m e n t o f M i c r o b io l o g y , T i a n j i n M e d i c a l U n i v e r s i t y , T i a n j i n 3 0 0 0 7 0 , C h i n a A b s t r a c t A I M;
4、T o c o n s t r u c t t h e r e c o m b in a n t e u k a ry - o t ic e x p r e s s io n p la s m id o f m u r in e m a c r o p h a g e in f la m m a t o ry p r o t e in - l a ( M I P - 1 a ) a n d in v e s t ig a t e t h e e ff e c t o f M I P - l a a s a n a d j u v a n t o n im m u n e r e s p o n
5、 s e in d u c e d b y h e r p e s s im p le x v ir u s t y p e I I g ly c o p r o t e in D ( H S V - I I g D )D N A v a c c in e . ME T H O D S ; U s in g t o t a l R N A f r o m R A W2 6 4 . 7 c e lls s t im u la - t e d w it h L P S , t h e w h o le c o d e s e q u e n c e o f m u r i n e MI P - l
6、 a w a s a m p l if ie d b y r e v e r s e t r a n s c r ip t io n p o ly m e r a s e c h a in r e - a c t io n ( R T - P C R ) a n d in s e rt e d in t o p c D N A 3 a t H in d I I I/ X b a I r e s t r ic t io n s it e s . T h e r e c o m b i n a n t e u k a ry o t ic e x p r e s s io n p la s m id
7、 P m w a s t r a n s ie n t ly e x p r e s s e d in C O S - 7 c e l ls a n d it s s p e c if ic ity w a s d e m o n s t r a t e d b y R T - P C R a n d b o y d e n c h e m - o t a x is c h a m b e r . B A L B / c m ic e w e r e im m u n iz e d w it h g D D N A v a c c in e a n d / o r M I P - l a ,
8、a n d t h e e ff e c t o f M I P - l a o n g D D N A v a c c in e w a s e v a lu a t e d b y d e t e c t in g a n t i- H S V - I I a n - t ib o d y , a n t ig e n - s p e c if ic ly m p h o p r o l if e r a t iv e r e s p o n s e s , a n d e x a m in in g s u r v iv a l r a t e s a ft e r m ic e w e
9、 r e c h a l le n g e d i n t r a v - a g in a lly w it h , H S V - I I . R E S U L T S : T h e r e c o m b in a n t e u k a ry o t - is e x p r e s s io n p la s m id o f m u r in e M I P - l a w a s c o n s t r u c t e d , a n d it w a s r e v e a le d t h a t im m u n e r e s p o n s e s o f H S
10、V - I I g D D N A v a c c i n e w e r e e n h a n c e d b y c o im m u n iz a t io n w it h M I P - l a . C ON C L U S I ON: T h e mu r in e MI P - l a c a n b e u s e d a s a n 摘 要 目的: 构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白 一 l a ( M I P - 1 a ) 的 真核表达质粒, 观察其作为分子佐剂对单纯疤疹病毒 I I 型 ( H S V - I I ) D N A疫苗免疫效果的影响。方法: 以US 刺激 R A
11、W 2 6 4 . 7 细胞提取总R N A 。采用R T - P C R扩增出M I P - 1 a基 因的 全部编码序列, 利用克隆载体p U C m - T , 将其亚克隆人 p e D N A 3 中, 构建出 小鼠M I P - 1 a 的真核表达质粒P M ; 将其转 染C O s 一细胞, 并用B o y d e n 趋化小室法检测M I P - 1 a的生物 学活性。 然 后用其与H S V - I I 少的D N A 疫苗一起免疫B A L B / c 小鼠, 检测免疫小鼠的特异性抗体、 脾 T细胞增殖反应及病 毒攻击小鼠 后对小鼠的保护率, 观察M I P - 1 。 对H
12、 S V - 1 1 D N A 疫苗免疫效果的影响。结果: 成功构建了小鼠M I P - 1 a的重组 真核表达质粒; 免疫 B A L B / c 小鼠发现, 其作为分子佐剂可 加强H S V - I I g D D N A 疫苗的免疫效果。结论: 小鼠M I P - 1 a 可 作为H S V - I I g D D N A疫苗的分子佐剂, 为研制新型有效的 H S V - 1 1 D N A疫苗提供一定的依据。 关键词小鼠巨噬细胞炎性蛋白一 l o t ( M I P - 1 a ) ; 单纯疤疹 病毒1 1 型( H S V - I I ) D N A疫苗; 分子佐剂 【 中图分类号
13、8 3 9 2 . 1 1 文献标识码A a d j u v a n t o f K e y w o r d s H S V - I I g D m unne DN A v a c c i n e . m a c r o p h a g e i n f la m m a t o ry p r o t e i n - l a ( M I P - l a ) ; h e r p e s s im p le x v ir u s t y p e I I ( H S V - I I ) ; D N A v a c c i n e ; m o le c u la r a d j u v a n t 收稿
14、日期 作者简介 2 0 0 5 一 0 4一 1 1 ; 邵文爱( 1 9 6 8 一 ) 修回日 期二 2 0 0 5 - 1 0 - 0 8 , 女, 山西平遥人, 讲师, 博士后. T e l : ( 0 7 5 4 ) 8 9 0 0 8 4 0 ; E m a i l : s w a 0 0 1 1 2 6 . c o m D N A 疫苗是2 0 世纪9 0 年代发展起来的一种新 的免疫疫苗。 其优点是制备简单, 安全, 诱导的免疫 应答广泛长久, 可以共表达免疫调节因子, 并且可以 根据需要诱导产生最适免疫应答等。虽然D N A疫苗 具有广泛的优越性, 但其诱导的免疫应答水平较低
15、, 妨碍了它们的实际应用。因而, 近几年来, 国外学者 一直 探索如 何强化D N A 疫苗的 免疫效果 1 , z , 其中 应用分子佐剂受到人们的关注, 展开研究并已显示 出 乐观的 应用前景 一 习 。 趋化因子因具有独特的免疫调节特性, 在接种 部位募集和激活特定细胞, 精确调节保护性免疫应 答, 可作为一种新型“ 智能型” 疫苗佐剂。尤其是趋 化因子在 C D 4 + 和C D 8 + 细胞因子分泌模式 T h l / T h 2 极化现象中起着重要作用, 被认为是疫苗效力的重 要决定因素。巨噬细胞炎性蛋白 一 1 a ( M I P - 1 a ) 属于 C - C 趋化因子家族即
16、R 趋化因子家族, 基因定位于 小鼠 第1 1 号染色体, 其作用无种属特异性。M I P - 1 a 可由多种细胞产生, 对多种免疫效应细胞包括 T细 胞、 B细胞、 单核细胞等具有显著趋化作用, 而且参 I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 ) 2 8 7 与淋巴细胞及单核细胞等免疫效应细胞在炎症或肿 瘤局部的激活及聚集过程。用其作为佐剂可驱动免 疫反应向T h l 型转化 “ , , 有效杀灭病毒等胞内 寄生 病原体。 本研究旨在构建小
17、鼠M I P - 1 a的真核表达质粒, 用其与H S V - 1 1 g D D N A疫苗一起免疫B A L B / c 小鼠, 观察其对 D N A疫苗免疫效果的影响。 1 、 一 材料 和 方 法 1 . 1 材料小鼠巨噬细胞系R A W 2 6 4 . 7 购自中国医学科学 院协和基础研究所; C O s 一细胞购自中国医学科学院血液病 研究所; V e ro细胞、 单纯疤疹病毒I I 型g D糖蛋白D N A疫苗 ( P g ) 由天津医科大学微生物教研室提供。p U C m - T载体、 U N I Q 1 0 柱式总R N A 提取纯化试剂盒购自 上海生工生物有限 公司; p
18、c D N A 3 , D H 5 a 和含L a c Z 基因的p c D N A 3 载体均为本 室保存。B o y d e n 趋化小室为美国N e u r o P r o b e I n c 产品, 未经 P V P 处理的多聚碳酸盐滤膜( 孔径8 a ,m , 直径1 3 m m ) 为美国 P o r e t i c s 公司产品。 4 - 6 周龄雌性 B A L B / c 小鼠购自天津医 科大学实验动物中心。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 M I P - l a基因片段的获得用细菌脂多糖( L P S ) 刺激 R A W 2 6 4 . 7 细胞, 3 7 9 0
19、孵育3h , 参照“ U N I Q 1 0柱式总R N A 提取纯化试剂盒” 说明书进行总 R N A的提取, 接着进行 R T - P C R反应, 获得M I P - 1 a 基因片段。 1 . 2 . 2 M I P - 1 a重组真核表达质拉( P m ) 的构建与鉴定 根据 文献 8 回收、 纯化R T - P C R反应产物中的M I P - 1 a 基因片段, 与p U C m - T 载体连接, 转化人感受态D H 5 a中。将此构建的 质粒用H in d I I I 和X b a I 双酶切下M I P - 1 o c 片段, 插人用相同 酶切的真核表达质粒p c D N
20、A 3 中, 构建出重组真核表达质粒 I M , 转化 人M o t 中。 用P C R 、 酶切和测序法进行鉴定。 1 . 2 . 3 M I P - 1 a 在C O s 一细胞中的表达和活性测定 用葡聚 糖 方 法 9 , 以 质 粒P m 转 染C O s 一 细 胞, 7 2 h 后 收 获 细 胞, 进 行R T - P C R 鉴 定; 1 周 后 用B o y d e n 趋 化 小 室 法! “ 测 定 表 达的 M I P - 1 a 蛋白 的 生物学活性, 以 含L a c Z 基因的p c D N A 3 载体作 为阴性对照, 结果在高倍镜下观察, 用趋化9 0 m i
21、 n 后按下式 计算出的趋化指数来表示: C I 二 待测样品作用下移行的细胞 数/ 阴性对照组移行的细胞数。 1 . 2 . 4 对小鼠免疫保护和病毒感染将小鼠随机分为4 组 ( 每组巧只) 进行免疫: A : 飞疫苗组; B : P g 十 P m疫苗组; C : p c D N A 3 空载体组; D : N S 对照 组。 免疫前1 周, 小鼠 双 后 肢 骨四 头 肌 各注 射 布比 卡因2 0 p ,L ( 1 0 0 N ,g ) 0 1 周 后同 部 位 免疫接种相应的质粒( 1 0 0 m) -和N S 溶液( 1 0 0 p , L ) 。 连续免 疫3 次, 第 1 次与
22、第2 次间隔1 周, 第2 次与第3 次间隔2 周。 末次免疫4 周后, 用2 0 IA含1 0 0 L D 、 的H S V - I I 病毒注 人各组小鼠阴道内使其感染。 1 . 2 . 5 疫苗诱导的免疫应答 动物免疫方法同前。在末次 免疫后第2 周及第4 周眼眶静脉采血, 收集血清; 末次免疫 后1 月, 处死小鼠, 无菌分离脾脏, 制备脾细胞。( I ) E L I S A 法检测血清中的特异性抗体: 用H S V - I I g D蛋白包被酶标板, 加入从 1 : 1 0 开始2 倍倍比稀释的待检血清, 用 H R P 一 羊抗鼠 I g G作为二抗, 同时设阳性、 阴性和空白对照
23、。结果以P / N 值 2 . 1 作为判断标准, 计算抗体滴度。( 2 ) 脾T 淋巴细胞增 殖反应: 无菌条 件下取出 脾脏, 制成脾细胞悬液, 加人%孔 培养板中, 每孔加1 0 0 p ,L , 每个样品3 个复孔, 并设阴性对 照孔、 阳性对照孔和空白对照孔。试验孔每孔加H S V - 1 I g D 蛋白1 0 0 p ,L ( 2 m g / L ) , 阴性对照孔加培养液1 0 0 p ,L , 阳性对 照孔加含P H A ( 5 m g / L ) 的培养液1 0 0 p ,L , 混匀后置3 7 C , 5 0 m UL C 0 2 培养箱中 孵育6 8 h 。 之后, 每
24、孔加M T T 2 0 IA, 混匀后继续培养4 h 。培养结束时, 室温下1 3 0 0 一 1 4 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n 。 吸弃上清, 每孔加1 0 0 p ,L D M S O , 充分溶解静 置1 0 m i n 后, 置酶标仪在波长4 9 2 n m处测定A值。以刺激 指数( S I ) 判断淋巴细胞转化程度: S I = 实验组A 4 9 s 值/ 阴性对 照组A 4 9 2 值。 1 . 么6 统计学分析 采用S P S S 1 0 . 0 软件进行统计学分析。 趋化指数和脾T细胞刺激指数的比较用方差分析; 小鼠血清 中 特 异 性 抗体的比 较
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- 小鼠 MIP1 表达 质粒 构建 HSV 核酸 疫苗 中的 应用
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