小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定.pdf
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1、2 0 0 8 年1 2 月 第1 8 卷第1 2 期 中国比较隈学杂志 C H l N E S EJ O U R N A L0 FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E D e c e m b e r 。2 0 0 8 V 0 1 1 8N o 1 2 小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 李建国b 2 ,颛孙永勋2 ,舟丕鑫1 ,张炜2 ,莫晓能2 ,吴浩2 ,李依群2 1 广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所,广州5 1 0 1 2 0 ;2 。中山大学附属第二医院,广州5 1 0 1 2 0 ) 【摘鬻l目的建积种扶小鼠骨髓巾分离培养闯充质千细胞
2、( M S C s ) 的嵩效方法。方滚采取赡壁缎胞 分离法分离和纯化小鼠骨髓问充质干细胞( m M S C s ) ,检测m M S C s 在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化 能力,用流式细胞术及屉微镜分别检测m M S C s 纯度和形态特征。结果m M S C s 贴壁生长后形态较均一,细胞形态 呈成纤维缓胞样,流式细胞本检测:C I ) 4 5 、C D I I b 、C D 4 4 及C D 2 9 分别为( 3 。3 4 ) 、( 2 4 1 ) 、( 9 8 4 6 ) 及( 9 9 。3 6 ) 。 筹4 筏m M S C s 经诱萼惹霹淹戚鸯缎耱纛貉耱缍藏分诧。续论逶
3、过蘩壁壤券霹泼麸枣鬣雷髓审分离臻莠窭褰纯 度m M S C s ,该方法效率高,稳定性好。 【燕键词】骨髓;间究质干细胞;小鼠;细胞培养 【巾嗣分类号】R 一3 3【文献标识弼】A【文章编嚼】1 6 7 1 7 8 5 6 ( 2 0 0 8 ) 1 2 0 0 2 8 0 4 I s o l a t i o n ,C u l t u r ea n dI d e n t i f i c a t i o no fM e s e n c h y m a lS t e m C e l l sf r o mM o u s eB o n eM a r r o w L IJ i a n - g u o t
4、 ”,Z H U A NS u n - y o n g x u n 2 ,R A NP i - x i n I ,Z H A N GW e i 2 ,M O ) ( i 静触,髑H 菇,L IY i 一掣矛 ( 1 G u a n 鼬o uI n s t i t u t eo fR e s p i r a t o r yD i s e a s e ,t h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l ,G u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ,G u a n g z h o u5 1 0 1 2 0
5、,C h i n a ; 2 T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fS u nY a t s e nU n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u5 1 0 1 2 0 ,C h i n a ) 【A b s t r a c t lO b j e c t i v e T oe s t a b l i s h 黼e f f i c i e n tm e t h o df o ri s o l a t i o na n de u l t o r eo fm e s e n c h y m a ls t
6、 e mc e l l s ( m M S C s ) f r o mm o u s eb o n en l R E w 。M e t h o d sT h em o n o n u c l e a rc e l l sw e r ei s o l a l e df r o mI T l O t l S eb o n em S I T O W 。髓地m M S C sw e r ee n r i c h e d a n de x p a n d e db yu s i n gb o n er t 1 矗r r O Wa d h e r e n tc u l t u r e ,1 1 I ea
7、b i l i t yo fo s t e o g e n i ea n da d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no ft h em M S C su n d e r d i f f e r e n ti n d u c t i o nc o n d i t i o n sw a sa s s e s s e d - 1 1 l ep h e n o t y p ew 私a n a l y z e db yf l o wc y t o m e t r y ( F C M ) a n dm o r p h o l o g yo ft h
8、em M S C s w a se x a m i n e da n da n a l y z e db yl i 出m i c r o s c o p y R e s u l t m M S C sw e r ea d h e r e n tc e l l sw i t has i m i l a rf l b r o b l a s t o i d s p i n d l e - 森8 一m o r p h o l o g yd u r i n gd i f f e r e n tp a s s a g e s T h ee x p r e s s i o n o fC I M 5 ,C
9、D I I b ,C 0 4 4a n dC D 2 9 麟( 3 3 4 ) ,2 。4 1 ) , ( 9 8 4 6 ) ,( 9 9 3 6 ) 诵em M S C sc o u l db ei n d u c e dt od i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s ta n da d i p o c y t e sc e l l s 。C o n c l u s i o nM o u s e m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sc 跏b ei s o l a t e da n de x p
10、a n d e db yu s i n gb o n e 枷I a n 肼a d h e r e n tc u l t u r e a n di ti sa ne f f i c i e n ta n ds t a b l e m e t h o d 【K e yw o r d s 】B o n em a r r o w ;M e s e n c h y m a ls t e mc e l l ;M o u s e ;c e uc u l t u r e 骨髓闯充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s , M S C s ) 是骨髓中造血干细胞外
11、的另一类舆有高度可 塑性的细胞群体,在特定的诱导条件下舆肖向成骨 细胞、软骨细胞、胍腱细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪 细胞等间质细胞分化的能力1 ,同时具有采集方便、 易在体外培养、诱导和扩增以及免疫原性低等特性, 【基金褒翻】广东省自然辩学慕众谍蘧资髓( 7 0 0 1 6 2 4 ) 。 【作者简介】李建国( 1 9 6 2 一) ,粥,教授,博士生。瑷在中山大学附属第= 医院从事哮喘和慢性阻塞性肺疾瘸的临床和实验研究。E n t a i l : j g i i 8 8 1 2 6 c o i n a 【通讯作者】樽丕鑫,E m a i l :p j u a n g z h m c e d
12、u 。 专毋 婚告拎蛉羧始1 5 究盼i 5 研龄扩霉喙 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 8 年1 2 月第1 8 卷第1 2 期 C h i nJC o m pM e d ,D e c e m b e r2 0 0 8 ,V 0 1 1 8 N o 1 22 9 被认为在基因治疗、细胞治疗、组织工程等领域具有 广泛的临床应用前景。近年来研究表明:M S C a 具有 免疫调节作用,可有效治疗移植物抗宿主病和系统 性红斑狼疮等胶原结缔组织病。在体外成功分离培 养纯化间充质干细胞是研究其作用的前提,本实验 采用贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 ( m M S C s ) ,并对其特性进行
13、分析,为将M S C s 用于组 织工程、细胞治疗、基因治疗等研究提供实验基础。 1 材料和方法 1 1 实验动物和主要试剂 健康4 周龄S P F 级B A L B c 小鼠,均为雌性( 广 东省实验动物监测所合格证2 0 0 6 A 0 0 3 号) ,D M E M F 1 2 培养基( G i b c o 公司)标准胎牛血清( G i b c o 公 司) ,抗小鼠单克隆抗体:A n t i C D l l b F I T C 、A n t i C D 2 9 F I T C 、A n t i C D 4 4 P E 、A n t i C D 4 5 F I T C ( e B i o
14、 s c i e n c e 公司) 。地塞米松、p 磷酸甘油、2 一磷酸 抗坏血酸、I B M X 、吲哚美辛、胰岛素购自美国S i g m a 公司。 1 2m M S C s 的分离及培养 健康4 周龄S P F 级B A L B c 雌性小鼠,脱颈处 死,7 5 酒精浸泡1 5m i n ,置于超净工作台内,无菌 取出股骨和胫骨,两端剪断暴露骨髓腔。用2 5m L 注射器以D M E M F 1 2 培养基冲出骨髓,然后将股骨 和胫骨夹碎,以培养基反复冲洗,收集致无菌离心管 中,制备细胞悬液,细胞计数后以含1 0 胎牛血清 的D M E M F 1 2 完全培养基重悬细胞,调整细胞浓度
15、 致有核细胞5 1 0 6 m L ,以2 1 0 6 c m 2 密度接种致 2 5c m 2 塑料培养瓶,置于3 7 、5 C 0 2 、饱和湿度培 养箱中培养。 1 3m M S C s 传代培养 7 2h 后首次全量换液去除未贴壁细胞,以后每 3d 全量换液。细胞达9 0 融合时传代,吸出培养 基,以P B S 缓冲液洗1 遍,以0 2 5 胰酶0 0 2 E D T A 消化5m i n ,1 :2 接种于2 5c m 2 塑料培养瓶中 扩增培养,置于3 7 、5 C O :、饱和湿度培养箱中培 养。 1 4 细胞形态学观察 每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态和贴壁 情况。 1 5M
16、 S C 表面标志的检测 取融合达9 0 的第4 代m M S C s ,以胰酶E D T A 消化成单细胞悬液,以P B S 缓冲液洗涤3 遍,血细胞 计数板计数,调整细胞浓度致1 1 0 6 m L ,分别加入 荧光标记的抗体( A n t i C D ll b F I T C 、A n t i C D 2 9 F I T C 、 A n t i C D 4 4 P E 、A n t i C I M 5 F I T C ) ,4 孵育3 0m i n ,P B S 洗去未标记抗体,1 多聚甲醛固定,应用流式细胞 仪分析样本中细胞相应标记抗原的阳性表达率,同 型I s G 作为相应的阴性对照
17、。 1 6m M S C s 诱导分化 成骨诱导:成骨诱导培养基:D M E M F 1 2 完全培 养基+ 1 0 。7m o l L 地塞米松+ 5 肛g ,I l l L2 磷酸抗坏血 酸+ 1 0m m o l LB 磷酸甘油,第4 代m M S C 接近融合 时置于成骨诱导培养基培养3 周,每天换液。3 周 后以P B S 冲洗1 遍,茜素红S ( p H4 2 ,S i g m a ) 室温 染色5m i n ,蒸馏水冲洗掉多余的茜素红S ,显微镜 下观察。 成脂诱导:成脂诱导培养基:D M E M F 1 2 完全培 养基+ 1 0 。8m o l L 地塞米松+ 5 弘g m
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- 小鼠 骨髓 间充质 干细胞 分离 培养 鉴定
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