旋毛虫新生幼虫CDNA文库构建及其特异性基因的筛选与鉴定.pdf
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1、C h i n e s ej o u m a lo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e中国兽医杂志2 0 0 8 年( 第4 4 卷) 第8 期 旋毛虫新生幼虫c D N A 文库构建及其 特异性基因的筛选与鉴定 姚春雨1 2 ,汪 ( 1 中国农业大学动物医学院,北京海淀1 0 0 1 9 3 ;2 明1 ,别、国权2 内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽0 2 8 0 4 2 ) 摘要:构建旋毛虫新生幼虫c D N A 文库并对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定,筛选出期特异性的基凶片 段。用x Z A P E x p r e s s 载体成功地
2、构建r 旋毛虫新生幼虫的c D N A 文库,并用放射性同位素r ”P 标记c D N A 探针对筛选 出的阳性克隆进行鉴定。所构建的c D N A 文库容量为1 9 2 1 0 6 ,重组效率为9 8 6 ,所有的克隆片段都在o 5 2 0k b 之 间,筛选获得7 个阳性克隆,其大小在1 4k b 左右;用放射性同位素口_ ”P 标记c D N A 探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼 虫及成虫新生幼虫c D N A 文库质粒D N A 进行S 0 u t h e r n 印迹杂交,结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫c D N A 文库质粒D N A 有杂交而与成虫、肌幼虫c D N A 文库
3、质粒D N A 不杂交。该基凶是新生幼虫期所特有的c D N A 片段。 关键词:旋毛虫;c D N A 文库;期特异性基因;筛选;鉴定 中图分类号:Q 7 8 9 文献标识码:A 文章编号:0 5 2 9 6 0 0 5 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一o 0 0 5 一0 3 c D N Al i b r a r yc o n s t r u c t i o n ,s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs t a g e s p e c i f i cg e n eo fn f e 庇f 珂P Z Z 口s p f
4、 ,口Z Z sn e o g e n e s i sl a r V a Y A OC h u n y u l “,W A N GM i n 9 1 ,S U NG u o q u a n 2 ( 1 C o l l e g eo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e ,C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B e 巧i n g1 0 0 1 9 3 ,C h i n a ; 2 A n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yC o l l e
5、 g e ,1 n n e rM o n g o l i a nU n i v e r $ i t yF o rN a t i o n a l l t y ,T o n g l i a o0 2 8 0 0 0 ,C h i n a ) A b s t r a c t :C o n s t r u c t i n gc D N Al i b r a r yo f 丁I r i c i 行P Z Z 口s p i r 口Z i sn e o g e n e s i s1 a r V a ,s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z i n gt h e
6、s p e c i f i co fT r i c i 咒已Z Z 口s 户i 7 一n Z i sn e o g e n e s i sl a r v a ,s t a g es p e c i f i cg e n ef r a g m e n tw a ss e l e c t e d C o n s t r u c t i n gc D N Al i b r a r yo f 丁r i c i 咒P Z Z ns 户幻r 口Z i sn e o g e n e s i sl a r v ab y 入Z A P E x p r e s sc a r r i e r ,a n dm a r
7、 k i n g c D N Ab o u g i eb yi s o t o p ea 一3 2P ,c h a r a c t e r i z i n gt h ep o s i t i v ec l o n e s C a p a c i t yo fc D N Al i b r a r yc o n s t r u c t e di s 1 9 2 1 0 6 ,r e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c yi s9 8 6 ,a l lt h ec l o n e ds e q u e n c eareb e t w e e nO 5 2 O
8、k b ,g e t t i n g s e v e np o s i t i v ec l o n e su s i n gh y b r i d i z a t i o no fn u c l e i ca c i df o rc D N Al i b r a r yo n e o g e n e s i sI a r v a ,a b o u t 1 。4k b ,a f t e rm a r k i n gc D N Ap r o b e sb yi s o t o p ea 一3 2P ,S o u t h e r n b l o ta n a l y s i si n d i c
9、a t e d t h eh y b r i d i z a t i o n w i t hc D N Al i bp l a s m i dD N Ao ft r i c h i n al a r v a ,i m a g o ,n o to fi m a g o ,m y o l a r v a T h eg e n ei sc D N Al i b r a r y s p e c i “cf o rT l r i f i 咒P Z 口5 户i r 口Z i sn e o g e n e s i sl a r v a K e yw o r d s :T r i f i 恕P Z Z ns
10、户i r n Z i 5 ;c D N Al i b r a r y ;s t a g es p e c i f i c i t yg e n e ;b o l t i n g ;c h a r a c t e r i z e a t i o n 旋毛虫病( T r i c h i n e I I o s i s ) 是一种流行广泛,危 害十分严重的人兽共患寄生虫病。全世界有1 0 0 多 种动物和6o o o 多万人感染此病,因此它不仅使畜 牧业生产遭受巨大的经济损失,而且也严重威胁着 人类的健康。目前,我国是世界旋毛虫病危害最为 严重的少数几个国家之一。 新生幼虫期和成虫期足旋毛虫3 个时
11、期中的两 个侵入期,而新生幼虫和成虫对机体的侵入除机械 收稿日期:2 0 0 7 0 9 3 0 作者撷介:姚春雨( 1 9 6 5 一) ,男( 蒙古族) 副教授。博士,主要从事 动物性食品安全方匾研究,E m a i l :”o c h u n y u 6 5 y a h 。o c o m c “ 作用外,势必依靠一定的特有的侵袭因子,而这些侵 袭因子极有可能就是新生幼虫和成虫与肌幼虫相比 所特有的致病性因子和强保护性抗原。 本试验就是利用旋毛虫新生幼虫期特异性探 针,在旋毛虫新生幼虫c D N A 文库巾,筛选出期特 异性的基因片段,为研制新型的、高效的、强免疫原 性的旋毛虫疫苗打下基础
12、。 1 材料与方法 1 1 实验动物W i s t a r 大鼠和昆明系小鼠;虫种: 中国河南猪旋毛虫分离株( 国际编号I S S 5 3 4 ) ;试 剂及试剂盒:地高辛标记检测试剂盒购自B O E 万方数据 6 中国兽医杂志2 0 0 8 年( 第4 4 卷) 第8 期 C h i n e s eJ o u r n a lo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e H R I N G E RM A N N H E I M 公司;放射性同位素 a 一3 2 P d C T P 购自北京亚辉生物医学工程公司;旋 毛虫肌幼虫、成虫及成虫和新生幼虫混合c D N A
13、 文 库由本实验室提供;入Z A P E x p r e s s 载体包装试剂 盒和m R N A 分离纯化试剂盒购自S T R A T A G E N G 公司;c D N A 合成试剂其他试剂购白P R ( ) M E G A 公司。 1 2c D N A 文库的构建 收集旋毛虫新生幼虫, 采用异硫氰酸胍一步法抽提总R N A 利用m R N A 分离纯化试剂盒提取及纯化D N A 。按c D N A 合成 试剂盒说明操作,按顺序进行第一链合成、第二链的 合成、末端平直、连接E c c ,R 上接头、E f o R 工末端磷 酸化、X oI 消化、过柱分离将合成的c D N A 连接在 入
14、Z A P 表达载体上,然后包装。 1 3 c D N A 文库质粒D N A 的提取 切割c D N A 文库及转染扩菌,取新生幼虫c D N A 文库1 0 8P F U 噬菌体,加入X L l 一B l u e 宿主菌( O D 一1 ) ,1 0 9 辅 助噬菌体,收集p h a g e m i d 。取新生幼虫c D N A 文库 的p h a g e m i d1p L 加入2 0 0 弘LX L O R 宿主菌 ( 0 D 6 0 0 一1 ) ,3 7 孵育1 5m i n ,再加入4 0 肚L5 N Z YB r o t h ,3 7 孵育4 5m i n ,取其中的l o
15、o 弘L 均 匀涂布于9 0m mL B K a n a + ( 5 0 “g m I 。) 琼脂平板, 3 7 过夜培养。取新生幼虫c D N A 文库的p h a g e m i d3 1 0 8P F U ,加入X L ( ) R 宿主菌( O D 。一1 ) 1 5 m L ,3 7 孵育2 0m i n ,加入2 0 0m LL BB r o t h ( 含 5 0 “g m L 卡那霉素) ,3 7 振荡培养2 0h ,制备质 粒D N A ,测定D N A 浓度后一2 0 保存备用。 1 4c D N A 探针的放射性标记用放射性同位素 a 一3 2 P d C T P 标记,
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- 旋毛虫 新生 幼虫 CDNA 文库 构建 及其 特异性 基因 筛选 鉴定
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