应用脑微透析技术建立L-DOPA引起的PD大鼠脑氧化损伤的模型.pdf
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1、中国药理学通 报 以, 尸 几 口 而侧 刀 如 9 比 .“刀 以 趾 以 n Z 。 刀N ov;23( 1 1 ) : 1 5 灯一 30 1 5 2 7。 令实验方法学令 应用脑微透析技术建立L-D O P A引起的P D大鼠脑氧化损伤的模型 王 丹 巧 , , 王 巍 , , 景 富 春 2 , 赵 晋 宁 , ( 1 , 中国中医科学院医学实脸中心, 北京1 007 00; 2 . 石河子大学药学院, 新疆 石河子832 佣2) 中国图书分类号: R 一 3 3 2 ;R3 22. 8 1 ;R3 6 3 一3 2 ; R446 . 1 ; R7 4 57; R9 7 1 . 9
2、; R卯1 . 9 3 文献标识码: A文章编号: 1 001 一1 978(2 佣7 ) 11一1 5 27 一 04 摘要: 目的应用脑微透析技术建立左旋多巴( 吞D O PA ) 引 起的P D大鼠脑氧化损伤的模型。方法一6 一 经基多巴胺( 6- O H D A ) 脑内注射造成P D大鼠 模型, 采用微透析技术, 脑内 灌流L 一 D O 以 、 水杨酸捕获经自由基和高效液相一电化学检 测, 动态观察L-你) P A处理前后大鼠纹状休细胞外液多巴胺 ( DA) 及其代谢产物, 轻自由 基被捕获所形成的2 , 3 一 二经基 苯甲酸( 2 , 3 一 D H B A ) 、 2 , 5
3、 一 二经基苯甲酸( 2 , 5 一 D H EA ) 浓度的 变化。结果吞1 幻P A处理后, 模型组大鼠2 , 3 一 D H B A和2 , 5 一 D H B A 浓度分别有6 个和7 个时间 点较对照组明显升高 p( 。 . 05尹 0 . 01) ; 还 原型 谷胧甘肚在多 个时间点抑制了 这种升高( 尸 0 . 仍, p aO I ) 。结论应用脑微透析技术 建立L-D O 以 引起的PD 大鼠 脑氧化应激损伤的急性模型, 可以进行在体的和动态的监测, 为筛选协同 以) P A治疗 PD 的抗氧化损伤药物提供有用的方法。 关键词: 左旋多巴; 脑内微透析; 经自由基;6 一 经基
4、多巴胺; 氧 化应激损伤 左旋多巴( L 一 D o P A ) 是多巴胺( DA ) 的前体, 通过重建 D A传递系统减轻帕金森病( PD ) 的症状, 延缓病程的进展, 收稿日期:2 叨7 一 05一 27. 修回日 期二 Z oc7 一 05一 09 基金项目: 国家中医药管理局资助项目( No以扔2 1 巧 5 ) 作者简介:王丹巧( 1 9 59一) , 女, 博士, 副研究员 硕士生导师, 研究 方向: 中西医结合老年医学基础研究, 通讯作者 侧: 。 】 。 - 6 2 8 7 5 599 吞牛 1 0.E - . 司 : d q es w 助岁 6 即 七 。 . 二 延长患
5、者寿命, 这是PD 治疗史上的重大进展。可是随着用 药时间延长和剂量加大. 非但不能取得进一步的疗效, 反而 产生病人难以耐受的副作用。本实验应用脑微透析方法造 模, 在清醒自由 活动状态下, 直接将吞 D O 队 灌流至PD 大鼠 纹状体, 为进一步研究 L-D O P A神经毒性机制提供一种可动 态监测的大鼠模型。 1 材料与方法 1 . 1 动物S D大鼠, 己, 休重1 80 2 佣 9, 购于北京维通利 华实验动物技术有限公司, 许可证编号二 3 X K( 京) 2 以 犯- 2 00 3 0 1 . 2 药品与试剂还原型谷耽甘肤( GSH) 购自积华药业有 限公司, 批号: 4 1
6、 21。 L- D O 以注射液购自 上海福达制药有限 公司 批号办如7 0 1 。林格液( 复方氯化钠注射液) 为北京双 鹤药业股份有限公司产品, 批号: AZoos o 1 o 52B 。 2 , 3 二羚基 苯甲酸( 2 , 3 一 D H B A ) 、 2,5二轻基苯甲酸( 2 , 5 一 D HB A) 、 水杨 酸钠、 1 一 庚烷磺酸钠(l一 hev耽 5 1 11 肠 11 1oac id耐in m汕 , HsA)、 三乙 胺( tri e th 刃 amine, TEA)j 一 o H D A 均购自51 , 11 a 公 司。乙二胺四乙酸四钠盐( ethy le n e
7、d i n etet ra a 日光 ti 。 二 记, te lr 四记iu ms alt, N E D T 八) 为北京福星化工厂产品; 乙睛 ( ac e 10 I 回e , A c N ) 和甲醇为Fi s h erc he面囚。 公司产品; 磷 酸( p ll 佣p llo ri c画d , 以 ) 为北京市红星化工厂产品。 1 . 3 仪器脑内微透析系统包括 C M 刀12探针( 透析膜长 4nun ) 及探针套管、 C M 拟1 2D 清醒动物装置、 C M刀1 02 微量 泵、 C M 刀1 10液体开 关、 C M 刀1 力低温样品自动收集器及软 件。 高效液相色谱( H P
8、LC) 系统包括C ” A 左阅除气装置、 P M 一0泵、 R ll e 司, ne 7125 进样阀、 比4C电化学检侧器 ( E D) 、 P H A S E 一 11柱子( 0 璐 3卜 口, 1 的 m mx3 . Zm m) 、 玻璃 i m en tsoft estin gm e m 衅 ac 咖s iti on( n二1 0 )an d m emo 耳。 ons 山dat io n ( n 二1 0 ) forthe r . TO e v al u a t e the b ehavio ral al t erat io nw i t hthe s ea g e n t , ,
9、as le p 一 t h ou gh P ass i v eavo i d anc e te stw asu se d .M i c e 朴adm i n is t ra- te da 召 e n 始b efOret r a i n i n gse c t i onfo r tes t i n g mem o ry朋- q u i si t io n , 山 ldadm i 衍 s t r a 伙 绒 l a g e nts i m m e di a 便 lya ft e r trai n i 叱 sec t i on for te s t in gmem o 砰 c o n soli d
10、at io n . The s t e p 】加u ghl aten c i e s a n d t 卜 e n u ll l be r ofe rrorso nl , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 and 7 d a y aft e r th e trai n in g we玲re c 耐e d . R esu l ts M i d azol am im p a i re dm e m o 俘甲i s i ti o nand c ons o l id a t io nwll e n司m i n i s t l a t e da o n eor i nc o 庄 山in a - u on
11、 w it hp e n e ll y c l i 山 n eh y d ro c h lo d d e . A d m in i s t ra t i o n ofm i d 咖 l am c o m b i n at ed 衍th那n e h y c U 击 ne h y d ro- c h lo ri d ed idn otw o rs en th ee 伟 戈 t on m emo ry朋q u i s i - t i o n , b u t worsenthe e ffec t on mem ory c o n 吕 o h d a li on 山- v i o u slr. F u
12、ll 】l e rm, , a 山n l n i s t rat fo nof而d azolam。 o m - b i n at e dw i t hp e n eh y c l i d in eh 川 ,喻ri de i 哪ai red m e m 呷 fo n c ti onp e rs istin g 玩罗 r th ant 卜 atofadm i ni 卜 t r a t i o nof mid a 2 0 la n lalo n e .Co ncl , i n nA d mi n i6 t ra- t i on of m i d 姗l a m andP e n e h y c l i
13、 di n eh y d r oc卜 l o ri d e M , :比 d d re s u lt in i n h i b i t i n g le arni n g and m e l l1 0 ryfi I l 1ct i on of m ic e . K e yw o r ds: mid az olam; p e n e h y c l i d i n e卜d rochl o ri d e ; le a rning a n dm e 咖可 万方数据 1 5 2 8 中国药理学通报chi。尸 尹翻 . m . 翻 刃 乙 9 比 川B u 儿 巴 仇2 叹 x l7N ov; 23(
14、11) T . b l Dy .而“ 曲d ” 川 甲 of e , 七 a c e ll” la r Z ,3 一 O H 日 A口. 沈 川, 目 。 . 恤蛇 由恤ofPD rats如 时 勿L-O o p A ( 脚 加】 Ll , 云 幻,。 二 句 h rfu s l 0 l l t l me/ m i n 32495427 C o n t rol 1 _ 5 2士0 . 1 4 7 6土6 . 1 0 87 土4 - 6. 5 5士2 . M创l e lCSH 5. 劝 士2 2 7 3. 99 士 162 3 2 8士 1 . 30 2 , 8 2士0 . 97 2 . 7 6
15、 士 0 . 盯 2 t 66 士0 97 2 5 3 土 0 _ 盯 2 1 7 土 0 . 佰 2 . 皿 士 0 . “ 2 _ 书】 士t 加 2 . 2 7 士 0 . 6 5 口 . 7 , 刁 9士2 . 自 ) 1 2 7 2土2 9 2 9 . 47 土 1 . 9 5 . 6 . 5 9士1 6 2 5 . 5 5 生 0 . 65. 4 . 6 1 士 0盯件 4 . 1 2 士 0 . 97口 3 . 76 士 0 . 3 2 . 3 . 2 1士0 . 犯 3 . 此 土0 65 2 8 2士0 t 65 2 . 8 2 士 0 . 6 5 , 2 . 7 6土0 3
16、 2 2 . 24 士0 . 9 7 . 1 8 一 粼 】 士7 . 1 4 1 1 1 6土6 , 1 6 6. 3 9土 1 . 9 5中 4 6 7土 1 . 0 3 5 0土0 . 9 7- 2. 5 6士0 _ 3 2二 2. 肠 士0 _ 6 5内 2 1 月 土0 65 由 . 2. 确 ,士0 石 5 2 0 1 土D . 3 2. 1 7 2士0 3 2二 2 . 1 1土 0 . 65 . 1 9 5士 0 3 2. 0135150165180195210225翎255270255知315 毕 0 . 05侈咖腼1 ; . p 。 . 05。 口 . p 。 . 01.皿
17、司 d .氏 . 帅 ti 毗 : A n 比 眯 击.吕 翻 扣 硒thL-1 洲 ) 】1 内 T a b Z 功 . m 阮 川 d 恤 川 举 时 玩 日对 函 加m of P D , 如七1 皿 谧 仍 d l C o n l . 。 曰 比 尸n 日 勺肠 r 脚 L 正K 】 PA 2 ,5 . D I 日 Ao . 口 。 扣b l 五 .旧 ( “ . L 一 1 , 玉出 : , 。 = 6 ) P e 币】 丽 。 n l i me Z mi nMI 司 dC S H 4 . 1 5士1 , 94 1 8 56 士7 . 46 蛇 , 叨 士4 86 8 . 86 土3
18、, 对 7 1 4土2 . 92 6 . 49 土2 . 92 5 . 65 士2 . 5 9 5 . 1 9土2 27 5 03 出2 . 27 4 . 8 0上2 . 幻 4 . 67 土2 . 5 9 4 . 3 2士2 72 4 _ 09 士2 . 灯 4 _ 1 5士2 5 9 7 . 30 士1 . 62 口746 士 2 _ 27. 2 2 . 42 土 2 . 9 220 . 1 8 士 4 . 2 1 先 1 7 . 23 士 3 . 8 9 .365 士 42 1 13. 27 士 2 27“9 . 肠 士 1 . 29 10. 64 士 0 . 97 “8 . 17 士
19、1 . 加 . 9 . 05 土 0 . 64 口6 . 8 1 士 1 _ 29 . 8 37 土 D . 吕“5 . 7 1 士 0 . 97 二 7 20 士 0 . 64.5 3 2 上 0 _ 卯 6 . 88 士 0 . 卯.5 . 22 出 1 . 29 6t 49 士 0 . 654 47 士0 . 97 . . 00 士 0 . 974 t 67 士1 . 62 5 94 土 0 654 t 3 8士1 . 94 5. 5 2 士 0 974 . 1 8士2 27 5 . 3 5士 0 972 9 5士2 _ 59 。135姗而180195210225240255270285
20、划315 碳工作电 极、 A 合 产 A 邪1 参考电 极和色谱工作站。 手术使用设 备: MF-5 3 麟立体定位仪、 C M刀1 50 动物温度控制器和 M 卜 5 3 印 牙科钻。以上仪器购自B A S和C MA公司。 1 . 4 动物分组、 造模方法和脑 内微透析大鼠19 只, 随机 分为对照组( C o Il t ro l ,生理盐水给药) 和手术组, 后者又分为 模型组( M 记el, 生理盆水给药) 和还原型谷胧 甘肚组( GSH, 300 mg k g 一 , ) 。 L- oo以处 理 前30m i n , 腹 腔 注 射 给 药 。 微 透析 前1 被, 戊巴比妥 钠40叱
21、 k g 一 , 腹腔注射麻醉, 于大鼠 脑纹 状体内 埋人探针套管( 定位坐标A : + 。 . Zm m , L :+ 3 二 , V: 7 . sm m) , 手术组经探针套管注射0 . 2 %的6 一 O H D A 生 理 盐 水 溶 液(3 2 叱 k g 一 , ) , 对 照 组 注 射 等 容 量 生 理 盐 水 。 1 能后, 各组大鼠 在清醒自由活动状态下插人微透析探针, 林格液( R ) 和5 功 n 1 0 1 L 一 , 水杨酸钠林格液( s R ) 分别灌流 各印m in后, 进行L- Do以 处理: 即0 . 25%乙 一 D o PA 注射液 灌 流印m in
22、 。 微透 析 灌 流 速度2 闪 m i n 一 , , 每15m in 收 集 1 管透析液。吞【 旧P A处理前4管透析液的均值作为基础水 平( 标记为0 而n ) , L 一 D O PA处理1 5 m in ( 标记为1 3 5m in ) , 收集透析液至3 巧 而n 。探针在使用前作回收率测定, 用以 折算透析液中2 , 3 一 D H B A 、 2 , 5 刃HBA和D A的浓度。 1 5 色 谱分 析 流动相组成: H SA I , 75 9 , TEA3 . s d, 以 4 . om l , A C N6 2 . 5而, N 、E l T 月住19 加蒸馏水至1 x l
23、 耐。 流速07 d 而 n 一 , , 氧化电压。7 5o v , 滤波0 . 10凡, 增益 50nAll 。 标 准曲 线: 用1 00、 50、 乃、 12 . 5 此 L 一 , 的2 , 3 - D H B A j, 5 一 D H B A和 D A混合标准进行测定。 1 . 统计学方法各组数据均以 云士, 表示, 用 S PSSfor 袱n d ows n. 0 软件进行单因素方差分析( one w a ,A N O v A) , 继以“D 检验( 方差齐) 或D u 仙e n”检验( 方差不齐) 进行 组间比较。 2 结果 2 . I L-DO P 冉处理前后 P D大鼠纹状体
24、细胞外液2 。 3.DH n A的动态变化见 T 曲 1 。与对照组 比较, 模型及给药组 2 , 3 一 D H B A基础水平均升高( P0 , 0 5 ) , 为6 一OH D A脑内注 射所致。L 一 D O 以 处理后, 各组2 , 3 一 D H B A水平立即升至最 高( 时间点1 35m in), 并在其 后的3 h 时内 缓慢下降至接近 或低于基础水平。L-D O 队 处理后, 与对照组比较, 模型组共 有6个时间点升高( P0 . 05) ; GsH组对吞D O 队 所致的2 , 3 一 D H BA 升高, 显示出较为明显的抑制作用, 有9 个时间点 与模型组比 较差异有
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- 用脑 透析 技术 建立 DOPA 引起 PD 大鼠 氧化 损伤 模型
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