急性弛缓性麻痹病例中ECHO11病毒的基因特征分析.pdf
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1、急性弛缓性麻痹病例中E C H O 1 1病毒的基因特征分析 刘桂艳1,许文波1,纪峰2,张勇1,王海岩2,李岩2,严冬梅1,徐爱强2 (1 .中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京1 0 0 0 5 0; 2 .山东省疾病预防控制中心, 济南2 5 0 0 1 4) 摘要: 该文首次分析了我国E C H O 1 1病毒的分子流行病学资料。1 9 9 9 2 0 0 4年, E C H O 1 1病毒是山东省急性弛缓 性麻痹 (A F P) 病例中分离到的优势毒株,2 0 0 3年从山东省4 8 2例A F P病例中共分离到1 1株E C H O 1 1病毒, 其中 相关的1 0例病例
2、分布跨越山东省大部分地区, 但发病日期集中在7月和1 2月。该研究试图通过对V P 1编码基因 全序列的测定和分析, 为探讨E C H O 1 1病毒与A F P之间的病因关系提供线索。分子流行病学研究提示, 1 1株E - C H O 1 1毒株都位于同一传播链, 核苷酸同源性为9 7 . 2 % 1 0 0 %, 氨基酸同源性为9 9 . 6 % 1 0 0 %, 其中7月和1 2 月的分离株之间相差8 9个核苷酸, 氨基酸序列一致。这说明山东省2 0 0 3年7月和1 2月分别发生了E C H O 1 1 病毒流行, 但这些毒株与A F P的病因关系尚需进一步研究。1 1株病毒组成了A基
3、因型中的一个新亚型, 在进化树 上单独呈密切相关的一簇, 与同基因型内的其它亚型的核苷酸同源性为8 2 . 2 % 8 4 . 7 %, 氨基酸同源性为9 4 . 8 % 9 7 . 6 %。 关键词: 急性弛缓性麻痹病例; E C H O 1 1病毒; 基因特征 中图分类号: R 3 7 3 . 2 4 文献标识码: A 文章编号: 1 0 0 0 - 8 7 2 1 (2 0 0 6) 0 1 - 0 0 2 2 - 0 9 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 8 - 0 4; 修回日期:2 0 0 5 - 0 8 - 2 2 基金项目: 卫生部疾病预防控制专项 (2 0 0 4 - 2
4、0 0 5) 作者简介: 刘桂艳 (1 9 7 1 -) , 女, 吉林省磐石市人, 硕士研究生, 主要研究病毒病的诊断及病毒的分子流行病学。 责任作者: 许文波,E - m a i l:w e n c h u n p u b l i c . b t a . n e t . c n E C H O病毒为小R N A病毒科肠道病毒属B组 肠道病毒, 包括2 8个血清型。E C H O病毒可引起脑 膜炎、 脑炎、 心肌炎及新生儿严重疾病 1 。世界各 地都有检测到E C H O病毒的报道, 有些地区有本土 毒株, 引起为数不多的散发病例, 但有些血清型经常 成为疾病暴发的病原。在肠道病毒中, 脊髓
5、灰质炎 病毒和柯萨奇B组病毒致病的分子基础已经有细 致的研究, 但对E C H O病毒的分子生物学特征以及 影响其致病性的宿主、 环境因素及病毒本身的特征 仍知之甚少。一种血清型的肠道病毒能引起多种疾 病, 但特定基因型的肠道病毒有时与特定的临床症 状有关。 我国的山东省地域广阔, 人口众多, 每年的 A F P病例大约有5 0 0例, 非脊灰肠道病毒分离率在 1 0 %上下波动。回顾性的资料分析表明, 在1 9 9 9 2 0 0 4年, 在分离到的非脊灰肠道病毒中,E C H O 1 1 病毒为优势流行株。其中2 0 0 3年山东省共分离到 1 1株E C H O 1 1病毒, 病例的地区
6、分布及麻痹时间分 布见表1。因为2 0 0 3年山东省A F P病例中的E - C H O 1 1病例呈聚集现象, 本研究试图为探讨E - C H O 1 1病毒与急性弛缓性麻痹之间的病因关系提 供线索。研究A F P病例中的E C H O 1 1病毒的分子 流行病学特征在国际上尚属首次。本研究比较了山 东省2 0 0 3年从A F P病例中分离到的E C H O 1 1病毒 之间, 以及它们与其它E C H O 1 1病毒的基因特征, 为E C H O 1 1病毒的致病性研究及在本土脊灰野毒 的传播已阻断的情况下, 急性弛缓性麻痹的病因研 究奠定基础。 材料与方法 1 病毒分离与鉴定山东省疾
7、病预防控制中心对1 9 9 9 2 0 0 4年A F P病例的粪便标本用R D、L 2 0 B和H e p - 2三种细 胞分离病毒, 病毒分离阳性标本做脊灰中和试验及肠道病毒 组合血清微量板中和试验, 进行脊髓灰质炎及其它非脊灰肠 道病毒的血清型鉴定。相关的实验步骤均按照世界卫生组 织 (WH O) 第4版 脊髓灰质炎实验室操作手册 中的规定操 作 2 , 其中的E C H O 1 1病毒送国家脊灰实验室做基因特征 鉴定。 2 V P 1区核苷酸序列分析 首先提取病毒核酸, 采用T R I - Z O L法提取病毒R N A, 按试剂盒操作说明操作, 提取病毒 R N A。然后进行R T-
8、P C R反应, 引物序列如下: 0 0 8:5 -G C RT G CA A TG A YT T CT C WG T- 3 0 1 1:5 -G C IC C IG A YT G IT G IC C RA A- 3 引物0 0 8、 0 1 1用于扩增包括全V P 1编码基因在内的约 9 7 0 b p大小的核苷酸片段, 扩增后的产物经纯化后进行序列 第2 2卷第1期 2006年1月 病毒学报 C H I N E S EJ O U R N A LO FV I R O L O G Y V o l . 2 2N o . 1 J a n u a r y2006 分析, 用于进行V P 1区碱基变异
9、的分析。首先用下游引物 0 1 1进行逆转录反应, 条件是4 2 5 4 m i n。灭活逆转录酶后, 利用P E公司的9 6 0 0型P C R仪, 加入上游引物0 0 8进行扩 增反应, 条件是: 高温启动9 4 3 m i n; 9 4 0 3 s,4 5 0 3 s,7 2 6 0 s, 进行3 0个循环; 最后7 2 0 1m i n结束反应。得到的 P C R产物经1 . 7 %T A E琼脂糖凝胶电泳测定是否成功地扩 增了这一片段。所用的AMV逆转录酶及T a qD N A聚合酶 均购自P r o m e g a公司。 P C R扩增后得到的产物用Q I A q u i c kG
10、 e lE x t r a c t i o nK i t (美国Q i a g e n公司) 胶纯化试剂盒进行纯化, 纯化方法参照 试剂盒说明书。纯化后进行标记反应, 为了提高全V P 1片 段的序列读取的准确度, 又采用了位于序列中间的两条引物 进行标记反应, 使所有片段都有双向标记, 它们是0 1 3: 5 - G G IG C RT T IC C YT C IG T CC A-3 ,0 1 2:5 -A T GT A Y G T IC C IC C IG G IG G- 3 。采用B i g D y e T MT e r m i n a t o rV 2 . 0 C y c l e S
11、e q u e n c i n gR e a d yR e a c t i o n试剂盒 (美国A B I公司) 进 行标记, 反应体系为: B i gD y e溶液8l, 标记用引物1l, 去离 子水9 l , 纯化后的P C R产物2 l 。根据P C R产物的强弱调 节模板量, 总体积为2 0 l 。标记反应过程为: 9 6 0 1s,5 0 5 s,6 0 4s, 进行2 5个循环后结束反应。标记后的产物经 s e p h a d e x T MG 5 0(瑞典法玛西亚公司)纯化后, 在P E公司 3 1 0 0型自动测序仪上自动测序, 方法参照测序仪说明书。 3 分析相关软件序列分析
12、校正整理软件采用S e q u e n c h e r 软件, V e r s i o n 4 . 0 . 5。核苷酸及氨基酸序列同源性分析采用 B i o E d i t S e q u e n c eA l i g n m e n tE d i t o r软件,V e r s i o n4 . 8 . 9, 构建 基因进化树软件为M e g a, V e r s i o n3 . 0。 4 G e n B a n k号 本文所述的基因序列已输入G e n B a n k, 它 们的G e n B a n k号为D Q 2 2 0 7 8 4 -D Q 2 2 0 7 8 7。 结果 1 病
13、毒分离与定型 1 9 9 9 2 0 0 4年, 山东省A F P病例中共分离到 E C H O 1 1病毒3 0株, 其中1 9 9 9年分离到2株,2 0 0 0 年分离到1 5株, 2 0 0 1年分离到2株,2 0 0 3年分离到 1 1株,2 0 0 2年和2 0 0 4年未分离到E C H O 1 1病毒。 其中2 0 0 3年的相关病例的麻痹日期见表1。 表1山东省2 0 0 3年从A F P病例分离的E C H O 1 1病毒的地区分布及病例麻痹时间分布 T a b l e 1 D i s t r i b u t i o no fE C H O 1 1s t r a i n s
14、 i s o l a t e d f r o mA F Pc a s e s i nS h a n d o n g i n2 0 0 3b yd i s t r i c t s a n d t h e i r p a r a l y s i s d a t e s C o d e o f v i r u s s t r a i nC o u n t y (C i t y, D i s t r i c t)d i s t r i b u t i o nD a t e o f p a r a l y s i s C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 2P i n g y i c o u
15、 n t yJ u l y2 4,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 4G u a n g r a o c o u n t yJ u l y2 6,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 3G u a n g r a o c o u n t yJ u l y2 5,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 5H u a i y i nd i s t r i c t,J i n a nc i t yJ u l y2 9,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 6P i n g y i c o
16、 u n t yD e c e m b e r 1,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1 1S h a n x i a nc o u n t yD e c e m b e r 1 7,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 7F u s h a nd i s t r i c t,Y a n t a i c i t yD e c e m b e r 8,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 8D o n g g a n gd i s t r i c t,R i z h a o c i t yD e c e m
17、b e r 1 2,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 9F e i c h e n g c i t yD e c e m b e r 1 5,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1 0L i n z i d i s t r i c t,Z i b o c i t yD e c e m b e r 1 6,2 0 0 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1Y i n g n a nc i t yJ a n u a r y9,2 0 0 3 2 E C H O 1 1分离株病毒的V P 1区基因序列结果的 同源性分析
18、通过核苷酸序列比对, C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 2与 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 3完全一致,C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 4与 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 5一致,C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 2、C H N S D - E 1 1 - 0 3 - 3与C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 4、C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 5相差1个核苷酸。C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 6、C H N S D - E 1 1 - 0 3 - 7、C
19、H NS D - E 1 1 - 0 3 - 8、C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 9与C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1 0核苷酸序列一致, 以上 1 0株病毒的氨基酸序列完全相同, 与C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1相差1个氨基酸。1 1株山东毒株与标准 株U S AC A 5 3 - G r e g o r y序列比对结果见图1, 核苷 酸及氨基酸序列同源性具体见表2。表2右上部分 为核苷酸同源性比较结果, 左下部分为氨基酸序列 同源性比较结果。 32 1期 刘桂艳等: 急性弛缓性麻痹病例中E C H O 1 1病毒的基因特征分析 4
20、2 病毒学报 2 2卷 图1山东省2 0 0 3年1 1株E C H O 1 1病毒的序列比对 F i g u r e 1 A l i g n m e n t o f s e q u e n c e s o f 1 1E C H O 1 1 i s o l a t e s f r o mS h a n d o n gP r o v i n c e,2 0 0 3 表2山东省2 0 0 3年E C H O 1 1病毒分离株V P 1区核苷酸序列与氨基酸序列同源性比较 T a b l e 2 C o m p a r i s o no fV P 1n u c l e o t i d e a n da
21、 m i n o a c i d s e q u e n c e i d e n t i t i e s a m o n g1 1E C H O 1 1 i s o l a t e s i nS h a n d o n g 2 0 0 3 S e q u e n c e o f U S AC A 5 3 - G r e g o r y C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 2 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 4 C H NS D - E 1 1 - 0 3
22、- 5 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 6 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 7 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 8 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 9 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 1 0 C H N S D - E 1 1 - 0 3 - 1 1 U S AC A 5 3 - G r e g o r yI D0 . 7 9 50 . 7 9 40 . 7 9 40 . 7 9 50 . 7 9 50 . 7 9 30 . 7 9 30 . 7 9 30 . 7 9 30 . 7 9 30 . 7 9
23、3 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 10 . 9 3 4I D0 . 9 7 30 . 9 7 30 . 9 7 20 . 9 7 20 . 9 7 70 . 9 7 70 . 9 7 70 . 9 7 70 . 9 7 70 . 9 7 7 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 20 . 9 3 10 . 9 9 6I D1 . 0 0 00 . 9 9 80 . 9 9 80 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 0 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 30 . 9 3 10 . 9
24、 9 61 . 0 0 0I D0 . 9 9 80 . 9 9 80 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 00 . 9 9 0 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 40 . 9 3 10 . 9 9 61 . 0 0 01 . 0 0 0I D1 . 0 0 00 . 9 8 90 . 9 8 90 . 9 8 90 . 9 8 90 . 9 8 90 . 9 8 9 C H NS D - E 1 1 - 0 3 - 50 . 9 3 10 . 9 9 61 . 0 0 01 . 0 0 01 . 0 0 0I D0 . 9 8
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