木犀草素对实验性肺纤维化大鼠组织中TGF-β1MRNA表达的影响.pdf
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1、Methods The cortical neurons of fetal rat were cul- tured in vitro. The antioxidant and protective effects of LMWH-SOD were observed by treating neurons with oxygen and glucose deprivation.Results LMWH- SOD reduced the number of cell death and the efflux of LDH and the content of NO, MDA and increas
2、ed the membrane fluidity after the injuries of cells. Conclu- sion LMWH-SOD has protective effects on cerebral cortical neurons through its action of scavenging free radicals. Key words: LMWH-SOD;cerebral cortical neurons; oxygen and glucose deprivation 木犀草素对实验性肺纤维化大鼠组织中 TGF-1 mRNA 表达的影响 龚国清,钱之玉,周 曙
3、 (中国药科大学药理学教研室, 江苏 南京 210009) 中国图书分类号: R-332; R 282. 71; R 284. 1; R 322. 35; R 342. 22; R 394. 2; R 563. 13; R 977. 4 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1466 -04 摘要: 目的 研究木犀草素对肺纤维化大鼠肺组织中转化生 长因子 (TGF-1)mRNA 的表达的影响。方法 大鼠气管 内灌注博来霉素致大鼠肺纤维化病变, 同时 ig 给予 40 mg kg -1的木犀草素连续 14 d, 观察肺重量指数和羟脯氨酸含量 的变化; 用 RT
4、-PCR 测定肺组织中 TGF-1 mRNA 表达水平。 结果 木犀草素可降低重量指数和羟脯氨酸含量, 延缓肺纤 维化进程, 并抑制 TGF-1 mRNA 的表达。结论 木犀草素 抗肺纤维化作用与其抑制肺组织中 TGF-1 mRNA 表达有 关。 关键词: 木犀草素; 肺纤维化; 转化生长因子-1 器官纤维化的共同特征是由于细胞外基质 (ECM) 过度沉积, 导致器官组织结构的改建。许多 细胞因子参与了这一过程, 特别是转化生长因子 (TGF-) , 被认为是关键的前纤维化因子, 是迄今发 现的最强的细胞外基质沉积促进剂。研究证实 TGF- 及其受体的表达水平在纤维化疾病的器官特 别是在纤维化
5、区域明显增高, 给予实验动物外源性 的 TGF- 能导致某些器官的严重纤维化, 而利用药 物减少 TGF- 的生成则能减轻实验性纤维化。这 些研究结果都证实了 TGF- 在器官纤维化的发生 上有着极其重要的作用 1, 2。 木犀 草 素 ( Luteolin)是 白 毛 夏 枯 草( Ajuga 收稿日期: 2005 -06 -11, 修回日期: 2005 -08 -27 作者简介: 龚国清 (1966 - ) , 男, 博士, 副教授, 研究方向:生化药理 学, Tel: 025-83271322,E-mail:gonggq hotmail. com; 钱之玉 (1941 - ) , 男,
6、教授, 博士生导师, 研究方向:生化 药理学, 通讯作者, Tel: 025-83271322 decumbus) 或青兰 (Dracocephalum integrifolium) 的有 效成分, 属弱酸性四羟基黄酮化合物。因其具有镇 咳、 祛痰、 抗炎、 抗过敏、 免疫增强及对金黄色葡萄球 菌、 肺炎双球菌、 绿脓杆菌等细菌有一定的抑制作 用 3。作者实验发现木犀草素可减轻实验性肺纤 维化病变程度 4, 为深入探讨其可能的作用机制, 本文采用 RT-PCR 法研究木犀草素对肺纤维化组织 中的 TGF- mRNA 表达的影响。 1 材料与方法 1. 1 动物 SD 种大鼠, -各半, 体重
7、180 220 g, 购自中国药科大学动物中心, 合格证号, SCXK (苏) 2002-0011。 1. 2 药品 博莱霉素 A5(bleomycin) , 天津市太河 制药有限公司产品, 批号: 20030522; 醋酸地塞米松 片 (dexamethasone) , 浙江仙居制药股份有限公司产 品, 批号: 20020912; 木犀草素 (luteolin) , 纯度 99% 以上, 由杭州福斯特化学品有限公司提供。 1. 3 主要试剂 反转录酶 AMV、 T4DNA 连接酶、 RNasin 均为 Promega 产品; dNTP 和 Olid (T) 10为上 海生物工程公司产品; T
8、aq 酶和 DNA 分子量标准 DL2000 购自 TaKaRa (大连) 公司; RNA 纯化试剂盒 (TRIzol) 为 Gibco/ BRL 公司产品; 琼脂糖 (电泳纯, Sangon 公司) ; 羟脯氨酸测定试剂盒购自南京建成 生物工程公司。 1. 4 主要仪器 BT124s 电子天平 (Sartorius 公 司) ; J2-MC 型高速冷冻离心机 (Beckman 公司) ; PCR 扩增仪 (美国 PE 公司 9600 型) ; RNA/ DNA 定 量检测仪 (Amersham QeneQuant 公司) ; 凝胶数码成 像系统 (Kodak 1D Electrophores
9、is Documentation and Analysis System 120) 。 1. 5 大鼠肺纤维化模型建立及给药 将 40 只 SD 6641中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) : 1466 9 大鼠, 按性别体重随机分成 4 组, 每组 10 只, 分为正 常对照组、 肺纤维化模型组、 地塞米松阳性给药组、 木犀草素给药组。用博来霉素 A5复制动物弥漫性 肺间质纤维化模型, 参照文献 5并稍作修改: 除正 常对照组动物外, 其余大鼠乙醚全身麻醉后仰卧于 实验台上, 固定头部及四肢, 切开颈部皮肤,
10、由气管 一次性注入博莱霉素 A5溶液50 l (A5剂量为5 mg kg -1) 。注药完毕后缝合皮肤, 将大鼠直立、 旋转, 尽量使药液在肺内均匀分布。手术过程严格无菌操 作, 24 h 后开始灌胃给药或等容的质量浓度为5 g L -1的 CMC-Na 溶液, 各药物均用 5 gL-1的 CMC- Na 溶液配成混悬液, 其中模型组灌胃给予 5 gL -1 的 CMC-Na 溶液 10 mlkg -1; 地塞米松组灌胃给予 5 mgkg -1; 木犀草素组灌胃给予木犀草素40 mg kg -1。给药体积均按 10 mlkg-1计, 上述各组动物 均连续给药 14 d。 1. 6 检测指标 1
11、. 6. 1 大鼠肺重量指数及组织中 HYP 的含量测定 于末次给药后 2 h, 将各组大鼠断头处死, 分离出 完整的肺, 称重, 其中左半部分迅速于液氮冻存, 用 于 RNA 提取; 右半部分肺称取 1g 加入 10 ml 生理 盐水做组织匀浆, 做成质量浓度为 100 gL -1的匀 浆液, 离心取上清液, 用 Lowry 法测定各匀浆液中的 蛋白质含量, 并用羟脯氨酸 (hydroxyproline,HYP) 测定试剂盒, 按其提供的方法进行测定 HYP 的含 量。 1. 6. 2 RT-PCR 测定肺组织中 TGF-1 mRNA 的表 达 1.6. 2. 1 肺组织总 RNA 抽提及定
12、量 首先用文献 方法制备肺组织匀浆 6。然后按 TRIzol RNA 提取 试剂盒说明进行。组织匀浆液加入预冷的 PBS 稀 释后, 直接加入 TRIzol 试剂 1 ml, 轻轻振荡, 置室温 5 min。加氯仿 0. 2 ml, 轻轻振荡, 置室温 2 3 min。 4, 12 000 rmin -1, 离心 5 min。吸取上层水相, 加 0. 5 ml 异丙醇, 置室温 10 min。4, 12 000 r min -1, 离心 10 min。弃上清, 沉淀中加入体积分数 为 0. 75 的乙醇 1 ml, 充分洗涤沉淀, 4, 10 000 r min -1, 离心 5 min。弃上
13、清, 室温干燥后, 沉淀重悬 于无 RNase 水中。取少量 RNA 样品进行适当稀释 后, 在 Amersham QeneQuant Pro RNA/ DNA Calcula- tor 上测 RNA 含量, 稀释成 0. 1 gL -1备用。 1. 6. 2. 2 TGF-1 的 PCR 引物设计 TGF-1 的 PCR 引物 P1 和 P2 是根据鼠 TGF-1 基因 (Gen- Bank BC013738) 序列设计的。TGF-1 的上游引物 P1 的序列为 5-GCTACTGCCGCTTCTGC-3 (21 37) 。TGF-1 的下游引物 P2 的序列为 5-GC- CACTCAGG
14、CGTATCAG-3 (569 586) , PCR 产物长 566 bp。内对照 GAPDH 的 PCR 引物 Pg1 和 Pg2 是 根据鼠 GAPDH(GenBank NM-001001303) 序列设计 的。GAPDH 的上游引物 Pg1 的序列为 5-TCACT- GCCACCCAGAAGA-3 (536 553) 。GAPDH 的下游 引物 Pg2 的序列为 5-AAGTCGCAGGAGACAACC-3 (834 851) , PCR 产物长 316 bp。以上由上海生工 有限公司合成。 1. 6. 2. 3 cDNA 合成 采用 20 l 反应体系, 在 PCR 管中依次加入 5
15、 RT-Buffer 4 l,10 mmol L -1 dNTP 2 l, 25 mmolL -1 MgCl20. 8 l, RNA 抑 制剂 1 U, Olid (T) 10 0. 2 g, 总 RNA 0. 4 g, 加无 RNase 水至 19 l, 混匀, 65预变性 15 min, 再加入 AMV 10 U, 42 1 h, 95 5 min 灭活反转录酶。 1. 6. 2. 4 PCR 取反转录产物2 l, 加入 PCR 混合 液 48 l (10 PCR-Buffer 5 l, 25 mmolL -1 MgCl2 4 l, 10 mmolL -1 dNTP 1 l, Taq 酶
16、2 U, 20 pmol L -1 TGF-1 上下游引物各 1 l, 20 pmolL -1 GAPDH 上下游引物各 1 l, 加双蒸水至 48 l) , 94预变性 5 min, 再进行 30 个 PCR 循环 (94 30 s, 50. 3 30 s, 72 30 s) , 最后72延伸10 min, 产 物置冰箱待测。 1. 6. 2. 5 产物检测 取 PCR 产物 10 l 在质量浓 度为 15 gL -1 的 EB 染色的琼脂糖凝胶上电泳。 用 Kodak 1 D Electrophoresis Documentation and A- nalysis system 120 进
17、行灰度分析。根据 TGF-1 与 GAPDH 灰度比值确定 mRNA 的表达水平 7。 1.7 统计学处理 数据用-x s 表示, 组间比较用 t 检验分析显著性差异。 2 结果 2. 1 木犀草素对实验性肺纤维化大鼠的肺重量指 数及肺组织的 HYP 含量的影响 在实验给药期结 束时, 动物称重并处死动物, 取出完整的肺组织, 剔 除气管, 用吸水纸吸尽血液, 称重, 以肺组织重量 (mg) / 动物体重 (g) 表示肺重量指数。结果发现, 博 莱霉素模型组的肺指数明显高于正常动物, 地塞米 松及木犀草素给药组的动物肺指数与模型组比较降 低 (P 0. 01) 。实验结果显示, 大鼠气管内注射
18、 5 mgkg -1的博莱霉素 14 d 后, 其肺组织中的 HYP 含量升高 (P 0. 01) ; 而地塞米松组和木犀草素给 药组的大鼠肺组织中 HYP 含量有不同程度的抑制 (P 0. 01) , 结果见 Tab 1。 2. 2 木犀草素对实验性肺纤维化大鼠肺组织中 TGF-1 mRNA 表达的影响 各组动物的肺组织的 7641中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) TGF-1 mRNA 的表达的电泳图见 Fig 1。经灰度分 析后发现正常肺组织中的 TGF-1 的 mRNA 表达量 较少, 单独给予博莱霉素
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