新型压电石英晶体免疫传感器抗体固定方法的建立.pdf
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1、中华医院感染学杂志2 0 0 5 年第 1 5 卷第4 期 3 7 3 论著 新型压电石英晶体免疫传感器抗体固定方法的建立 罗阳, 府伟灵, 张雪, 张波, 陈鸣, 黄君富, 夏涵 ( 第三军医大学西南医院, 重庆 4 0 0 0 3 8 ) 摘要:目的探讨并建立一种高效免疫微阵列传感器抗体固定的方法。 方法分别采用普通蛋白A ( S P A ) 法与 经琉基取代S P A ( 自 组装S P A ) 法固定石英晶体微阵列上抗体, 并用石英晶体微天平( Q C M) 分别检测其不同浓度 抗体、 抗原条件下发生抗原抗体反应, 并对其抗体包被量、 反应频率漂移、 非特异性反应等多项指标进行统计学分
2、 析。 结果与传统S P A法相比, 自 组装S P A具有抗体固定量大、 反应速度快、 频率下降明显、 非特异性反应低等 优点。 结论自组装S P A法具有比普通S P A法包被一致性更高的优点, 可以作为新一代免疫传感器的抗体固定 方法 。 关键词: 石英晶体微天平; 免疫传感器;自 组装; 抗体 中图分类号: R 3 7 2文献标识码: A文章编号: 1 0 0 5 - 4 5 2 9 ( 2 0 0 5 ) 0 4 - 0 3 7 3 - 0 4 E s t a b l i s h me n t o f a N o v e l A n t i b o d y I mm o b i l
3、i z a t i o n Me t h o d o n P i e z o e l e c t r i c Q u a r t s C r y s t a l I mmu n o s e n s o r L UO Y a n g , F U We i - l i n g , Z HA N G X u e , Z HA N G B o , C HE N Mi n g , HU AN G J u n - f u , X I A Ha n ( S o u t h w e s t Ho s p i t a l , t h e T h i r d Mi l i t a r y Me d i c a l
4、 U n i v e r s i t y , C h o n g q i n g 4 0 0 0 3 8 , C h i n a ) A b s t r a c t : O B J E C T I V E T o d i s c u s s a n d e s t a b l i s h a h i g h l y e f f e c t i v e m e t h o d t o i m m o b i l i z e a n t i b o d y ( A b ) o n t h e s u r f a c e o f i m m u n o s e n s o r m i c r o a
5、 r r a y . ME T H O D S C o m m o n p r o t e i n A ( S P A ) a n d s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r s S P A ( S A Ms S P A ) w e r e u s e d t o i m m o b i l i z e t h e a n t i b o d y o n t h e m i c r o a r r a y r e s p e c t i v e l y . T h e n d i f f e r e n t c o n c e n t r a
6、 t i o n o f a n t i b o d y a n d a n t i g e n c o n j u g a t e d o n t h e q u a r t s c r y s t a l m i c r o b a l a n c e ( Q C M) t o c o m p a r e t h e d i f f e r e n c e o f t h e q u a n t i t y o f a n t i b o d y i m m o b i l i z e d , t h e t i m e s p e n t i n t h e p r o c e s s
7、o f A g - A b c o m p l e x f o r m e d a n d t h e n o n s p e c i f i c r e a c t i o n b e t w e e n u n r e l a t e d a n t i g e n . R E S U L T S Mo d i f i e d S P A h a d t h e a d v a n t a g e o f m o r e a n t i b o d y i m m o b i l i z a t i o n , l e s s t i m e c o n s u m e d i n t e
8、 s t i n g a n d l o w e r n o n s p e c i f i c r e a c t io n . C O N C L U S I O N S S A Ms S P A h a v e b e t t e r a b i l i t y t o i m m o b i l i z e a n t i b o d y a n d c a n b e a p p l i e d t o i m m o b i l i z e a n t i b o d y o n t h e s u r f a c e o f a n e w g e n e r a t i o n
9、 i m m u n o s e n s o r . K e y w o r d s : Q C M; I m m u n o s e n s o r ; S A Ms ; A n t i b o d y 生物传感器自从问世以来, 便以其独特的高敏 感度、 高通量、 低成本、 操作简单方便等特点迅速得 到了广泛应用。压电生物传感器的理论 1 8 8 5 年由 R a l e i g h 第一次提出, 但第一次真正全面的研究却 是由J a c q u e s C u r i e 和 P i e r r e C u r i e 在 1 8 8 0年完成 的 I 。 它即是利用质量负载效应, 使处于
10、振荡天平 中的石英晶体的共振频率发生改变, 再利用特殊的 读卡设备来检测其间的频率变化, 并通过其频率变 收稿日期: 基金项 目: 通讯作者 : 2 0 0 4 - 1 1 - 1 0 ; 修 回 日期 : 2 0 0 5 - 0 2 - 2 0 国家8 6 3 计划重大专项( 2 0 0 2 A A R Z 2 0 2 3 ) 国家自然科学基金( 3 0 2 7 0 3 8 8 ) 军队“ 十五” 课题( 0 1 MA 1 8 0 , 0 1 L O 6 5 ) 重庆市应用基础研究项目( 2 0 0 2 - 1 0 - 7 8 ) 重庆市科委攻关项目( 2 0 0 4 - 2 0 - 1 2
11、 ) 府伟灵, E m a il ; w e i l in g f u )y a h o o . c o m 化值E 2 1 来确定晶体上面所负载的准确质量数, 从而 在理论上为石英晶体微天平用于检测质量改变奠定 了坚实的理论基础。 生物传感器领域中, 基于抗原抗体反应的免疫 传感器是传感器系列中研究得最早也是最为成熟的 了, 但是对于在保持抗体的相关活性不变的条件下 对抗体包被量的控制问题, 即如何提高晶体表面抗 体的包被效率则为更多的人关注。现在已有多种商 业可行的物理及化学吸附方法来将抗体固定于固相 载体上, 为了增强传感器的敏感性, 传导元件表面与 抗体包被层之间的距离应为一个二维结构
12、 3 。为了 构建一个简便可靠的抗体分子层, 葡萄球菌 A蛋白 ( S P A ) 常被用来作为结合物质。S P A是由金黄色 葡萄球菌细胞壁中抽提出的成份, 它能够与抗体分 子的F 。 段结合而不破坏抗体与抗原结合能力 4 1 , 再 C h i n 1 No s o c o mi o l Vo l . 1 5 No . 4 2 0 0 5 利用蛋白工程技术将 S P A固定于固相载体表面, 这 样, S P A介导的抗体包被过程就能提供高效的免疫 反应过程, 从而提高系统性能。但有文献报道直接 的S P A物理吸附的洗脱率较高。最近, 抗体分子自 组装技术( S A Ms ) 被应用于传感
13、器的包被 5 1 。由于 在生物学表面特别是细胞膜表面, 要发生许多基本 的生物学识别及传导过程, 这就要求免疫传感器必 须具备排列整齐的生物分子膜。以前的文献少有报 道将 S P A的表面基团用琉基代替的, 本实验就是利 用 N - 琉拍酞- 3 - 2 一 联硫基毗咙一 丙酸盐( S P D P ) 和二 硫苏糖醇( D T T ) 在S P A表面形成琉基( - S H ) E 6 以 加强与金膜的结合。包被抗体后, 再用压电石英传 感器进行频率检测, 并与常规 S P A方法进行比较。 1 材料与仪器 1 . 1 仪器与器材A T切型石英晶振, 双面镀金电 极, 石英晶体基频为 I O
14、 MH z , 晶体采用 1 3 m m X 1 3 m m的方片, 金膜电极直径为 4 m m, 晶振两电极 分别引出到相应的固定槽壁, 检测池上盖有直径 6 m m的圆孔( 便于加样) , 由信息产业部电子第 2 6 研究所生产制备。 1 . 2 频率计数卡台湾研华公司 P C L - 8 3 6 型多功 能计数卡、 美国A d i n k公司的A C L - 8 4 5 4 型多功能 计数卡。 频率采集分析软件 P E S A V 2 . 0 版, 具有 实时检测频率并进行计数、 差值显示频率、 绘制数据 图表、 绘制检测趋势图等特点。 1 . 3 主要试剂N - 唬拍酞- 3 - 2
15、一 联硫基毗咤一 丙酸盐 ( S P D P ) 和二硫苏糖醇( D T T ) 均购自美国S i g m a - A l d r i c h 公司。S P A购于分装 自S i g m a的华美公 司。 抗人免疫球蛋白( I g G ) 单克隆抗体购自美国 S i g m a - A l d r i c h 公司( P B S 溶液 p H 7 . 2 ) . P B S 缓冲 液: 0 . 0 5 M, p H 7 . 2 , 含有N a C l ; 自 行配制。 P i r a n h a 溶液( 浓 H C l = HNO3 = 3 : 1 ) , 自 行配制。所用其 他试剂均为A R
16、级。 溶液, 用来打开 S P A - S P D P之间的二硫键, 并形成疏 基基团( - S H ) 。由于S P A, S P D P , D T T都是在 2 8 0 n m 处具有最大吸光度值, 通过监测其在 2 8 0 n m处吸光 度值的改变来分离修饰后的S P A . 2 . 3 S P A在晶体表面的组装 2 . 3 . 1 未修饰S P A法吸附 将金膜表面经过预处 理石英晶体在S P A溶液中浸泡 1 2 h , 在S P A完全 吸附到金膜表面后, 再将石英晶体用 l o m m的硅酸 盐缓冲液冲洗, 随后再用去离子水冲洗。将抗人免 疫球蛋白单克隆抗体 5 川, 均匀涂
17、布于已包被了 S P A的石英晶体金膜表面; 抗体固定后的石英晶 体, 用P B S 缓冲液冲洗1 0 次, 再加人1 %的B S A溶 液1 0 0 川, 反应1 h , 封闭晶体表面未结合的活性位 点; 用P B S 缓冲液和三蒸水冲洗, 氮气吹干备用。 2 . 3 . 2 修饰S P A法自 组装 将金膜表面经过预处 理石英晶体在修饰后的S P A溶液中浸泡 1 2 h , 待 S P A完全在金膜表面形成自 组装后, 再将石英晶体 用 l o m m的硅酸盐缓冲液冲洗, 随后再用去离子水 冲洗。为了减少蛋 白凝集, 再将石英晶体浸人 0 . 0 5 0 o T w e e n 2 O
18、( l O m M) 缓冲液中2 h 。 最后取出用 去离子水冲洗, 氮气吹干。将晶体浸入抗人免疫球 蛋白 单克隆抗体溶液中6 h , 取出石英晶体, 用P B S 缓冲液冲洗 1 0 次待用。 2 . 4 人免疫球蛋白的检测将用两种方法包被抗 体的石英晶体分别加人到微阵列中, 具体分布如下: 分别加人1 0 0 川检测缓冲液, 待频率稳定后记录基 频f l , 加入1 0 闪不同浓度的标准血清, 检测并记录 抗原抗体结合稳定后频率 f 2 , 频率的变化 f = f l - f , , 通过检测其频率变化 f , 比较不同S P A固定方 法对检测结果的影响。 2 . 5 统计学分析采用 S
19、 P S S 1 2 . 0统计分析软件 进行t 检验和X a 检验。 3 结果 2 方法 2 . 1 石英晶体金膜表面的预处理将已镀上金膜 电极的 石英晶体放人p i r a n h a 溶液中置于1 0 0 处 理5 m i n , 然后立即将投入表面清洁处理后的芯片投 入纯乙醇溶液中浸泡 3 0 m i n a 2 . 2 蛋白A的修饰过程在0 . l m g / m l 含有l o m m 的硅酸盐缓冲液的S P A中加入 1 0 0 倍过量浓度的 S P D P溶液, 其中S P D P作为异( 基) 双功能试剂, 未反 应的S P D P用充有葡聚糖凝胶的凝胶层析柱洗脱。 随即在修
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