新生小鼠缺氧缺血后P53的表达及其抑制剂对脑损伤的影响.pdf
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1、第8 卷第2 期 2 0 0 6 年4月 中国当代儿科杂志 C h i n J C o n t e m p P e d i a t r Vo l . 8 No . 2 A p r . 2 0 0 6 实验研究 新生小鼠缺氧缺血后p 5 3 的表达 及其抑制剂对脑损伤的影响 徐发林, 朱长连, 王小阳, 邱林, 吉玲, 程秀永, 染斌 ( 郑 州 大 学 笔 三 附 属 医 院 儿 科 , 河 南郑 州4 5 0 0 5 2 ) 摘要 目的 p 5 3 诱导的神经细胞凋亡在缺氧缺血性脑损伤及神经系统退行病变的发生中起重要作用, p 5 3 抑制剂p i f i t h r i n - a ( P
2、 F T - a ) 在多种动物实验模型中显示神经保护作用。该研究旨在探讨未成熟脑在缺氧缺血 ( H I ) 后p 5 3 表达的时相变化及p 5 3 抑制剂P F T - a 干预对脑损伤的影响。方法 新生9日 龄C 5 7 / B L 6 小鼠 在H I 后 3 , 8 , 2 4 , 7 2 h 处死取 脑组织进行p 5 3 和细 胞微管相关蛋白 一 2 ( M A P - 2 ) 免疫组化染色, 探讨p 5 3 表达的 时相变化及其 与神经细胞损伤的关系; 为了探讨P F T - a 是否对缺氧缺血性脑损伤有保护作用, 新生9日 龄C 5 7 / B L 6 小鼠 分别于 H I 后即
3、刻给予不同剂量( 1 , 2 , 8 m g / k g ) 的P F T - a 腹腔注射以及2 m g / k g 的P F T - a 分别在H I 前1 h , H I 后即刻及H I 后I h 腹腔注射, 在H I 后7 2 h 灌注取脑, 进行脑损伤的大体形态学评分。结果 正常脑组织户3 免疫组化染色偶 见阳 性细胞, H I 后p 5 3 的免疫反应性增加, 缺氧缺血侧大脑皮层、 海马及纹状体的户3 阳 性细胞数明 显高于正常对 照组及对侧大脑半球( P 0 . 0 5 ) 。结论新生小鼠缺氧缺血后早期脑组织两3 即 开始表达; 两3 的表达与神经细胞损伤分布区域一致; 单纯应用
4、户3 抑制剂P F T - a 对未成熟脑缺氧缺血性损伤无明 显保护作用。【 中国当 代儿科杂志, 2 0 0 6 , 8 ( 2 ) ; 1 3 7 - 1 4 0 关键词 p 5 3 ; 缺氧缺血, 脑; 小鼠, 新生 中图分类号 R - 3 3 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 8 - 8 8 3 0 ( 2 0 0 6 ) 0 1 一 。 一 。 E x p r e s s i o n o f p 5 3 i n n e o n a t a l mi c e f o l l o w i n g h y p o x i a - i s c h e m i a a n d e f f
5、e c t s o f i t s i n h i b i t o r o n n e o n a t a l b r a i n i n j u r y X U F a - L i n , Z H U C h a n g - L i a n , W A N G X i a o - Y a n g , Q I U L i n , J I L i n g , C H E N G X i u - Y o n g , L U A N B i n . D e p a r t m e n t o f P e d i - a t r i c s , T h i r d A f f i l i a t e
6、d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y , Z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2 , C h i n a ( E m a i l ; x u f a l i n 7 2 1 2 6 . c o m ) A b s t r a c t ; O b j e c t i v e p 5 3 - i n d u c e d a p o p t o s i s i s c r u c i a l i n t h e d e v e l o p m e n t o f h y p o x i c - i
7、s c h e m i a( H I ) b r a i n d a m a g e a n d n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r s . S o m e e x p e r i m e n t a l r e s e a r c h h a s s h o w n t h a t a s y n t h e t ic i n h i b i t o r o f 卢3 c a n p r o t e c t n e u r o n s a g a i n s t a p o p t o s i s . T h i s s t u
8、 d y a i m e d t o e x p l o r e t h e e x p r e s s i o n o f p 5 3 i n n e o n a t a l m i c e f o l l o w i n g H I b r a i n d a m a g e a n d t h e e ff e c t o f p 5 3 i n h i b i t o r ( p i f i t h r i n - a , P F T - a ) o n b r a i n d a m a g e . Me t h o d s H I w a s i n d u c e d i n 9
9、 - d a y - o l d m i c e p u p s b y l i g a t i o n o f l e f t c a r o t i d a r t e ry a n d 1 0 % o x y g e n e x p o s u r e f o r 5 5 m i n u t e s . T h e p u p s w e r e s a c r i f i c e d a n d t h e b r a i n s w e r e t a k e n o u t a t 3 , 8 , 2 4 ,a n d 7 2 h r s p o s t - H I . T h e
10、 b r a i n s w e r e s e c t i o n e d a n d s t a i n e d w i t h a n t i b o d y a g a i n s t 户3 a n d m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 2 ( M A P - 2 ) . P F T - a w a s i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y ; i n e x p e r i m e n t 1 i m m e d i a t e l y a
11、f t e r H I w i t h d i f f e r e n t d o s a g e s( 1 , 2 a n d 8 m g / k g ) ; i n e x p e r i m e n t 2 2 m g / k g a t d if f e r e n t H I t i m e s( 1 h r b e f o r e H I , a n d i m m e d i a t e l y a n d 1 h r a f t e r H I ) . C o n t r o l a n i m a l s w i t h o u t H I r e c e i v e d i
12、 n j e c t i o n s o f 0 . 5 % d i m e t h y l s u l f o x i d e . B r a i n d a m a g e w a s e v a l u a t e d b y g r o s s m o r p h o l o g y s c o r i n g a t 7 2 h r s a f t e r H I . R e s ul t s T h e n u m b e r o f 户3 p o s i t i v e c e l l s i n t h e c o r t e x , h i p p o c a m p u s
13、 a n d s t r i a t u m o f t h e i p s i l a t e r a l h e m i s p h e r e i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y a n d p e a k e d a t 3 - 8 h r s p o s t - H I w h e n c o m p a r e d w i t h t h o s e o f c o n t r a l a t e r a l h e m i s p h e r e a s w e l l a s n o r m a l c o n t r o l
14、 s . T h e p o s i t i v e c e l l s d i s t r i b u t e d m a i n l y i n t h e M A P - 2 n e g a t i v e a r e a . B o t h d i f f e r e n t d o s a g e s a n d d i ff e re n t i n j e c t i o n t i m e P F F - a t r e a t m e n t d i d n o t r e d u c e t h e e x t e n t o f b r a i n d a m a g e
15、 . C o n c l u s i o n s T h e i m m u n o a c t i v i t y o f 币3 i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y a s e a r l y a s 3 h r s p o s t - H I . T h e d i s t r i b u t i o n a r e a o f p 5 3 e x p r e s s i o n w a s c o n s i s t e n t w i t h t h a t o f b r a i n d a m a g e . T h e p 5
16、3 i n h i b i t o r P F T - a h a s n o p r o t e c t i v e e f f e c t s a g a i n s t H I b r a i n d a m a g e i n n e o n a t a l m i c e . C h i n J C o n t e m p P e d i a t r , 2 0 0 6 , 8 ( 1 ) ; 1 3 7 一 1 4 0 K e y w o r d s户3 ; H y p o x i a - i s c h e m i a , b r a i n ; M i c e , n e o
17、n a t a l 收稿日 期 2 0 0 5 - 0 9 - 0 2 ; 修回日 期 2 0 0 6 - 0 2 - 0 2 基金项目 国家自 然科学基金项目 部分资助( 编号3 0 4 7 0 5 9 8 ) 0 作者简介 徐发林, 男, 博士在读, 医师。主攻方向: 新生儿脑损伤的基础与临床研究。 1 3 7 第8 卷第2 期 2 0 0 6 年4月 中国当代儿科杂志 C h i n J C o n t e m p P e d i a t r Vo l . 8 N o . 2 A p r . 2 0 0 6 新生儿缺氧缺血性脑损伤是导致新生儿致死、 致残的常见疾病, 其发病机制涉及急性能
18、量衰竭、 兴 奋 毒 性、 氧 化应激、 炎症反应、 凋亡等多个方面 1 ,2 1 , 其中凋亡在未成熟脑缺氧缺血导致的神经细胞死亡 中 起重 要作用 , 有报道叫显示抑制神经细胞凋亡 对未成熟脑损伤动物模型有保护作用, 但研究结果不 一致。 肿瘤抑制蛋白p 5 3 是体内重要的转录因子和 凋亡介质, 缺W/ 缺血刺激后或神经系统退行病变时 表达明显增加, 并在凋亡级联反应的上游对细胞死亡 发 挥 重 要 调 控 作 用5 1 。 有 研 究 报 道6 ,7 应 用p 5 3 抑 制 剂p i fi t h i i n - a ( P F T - a ) 能够有效减轻缺血、 谷氨酸兴 奋毒性、
19、 淀粉样R 多肤所导致的脑损伤, 但对未成熟 脑缺氧缺血性脑损伤的影响尚未见报道。本研究从 组织学方面探讨 新生小鼠 在缺氧缺血( H I ) 后神经细 胞p 5 3 蛋白 的表达变化及其与脑损伤的关系, 并探 讨应用不同剂量或者不同时间应用 p 5 3 抑制剂 p ifi t h ri n - 。 对新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的影响。 1 材料与方法 1 . 1 缺氧缺血脑损伤模型的制备 新生9日 龄C 5 7 / B L 6 小鼠, 雌雄兼有, 经氟烷 吸入麻醉, 分离并结扎左颈总动脉, 缝合皮肤伤口 后 放回 母鼠笼恢复6 0 m i n , 而后将其放人充有湿化的 含氧1 0 %的氮氧混
20、合气3 6 恒温箱5 5 m i n 即制成 脑缺氧 缺 血( H I ) 模型 8 ,9 1 。 缺氧 后的 新生小鼠 放回 母鼠 笼中 恢复其环境温度, 在缺氧后3 , 8 , 2 4 , 7 2 h 处死进行脑组织学检查。空白对照组动物不进行动 脉结扎和缺氧处理, 在出生后第9 天或第1 2 天处死 进行脑组织学相关检查。 1 . 2 标本的制备 实验组 3 2只新生小鼠在缺氧缺血后 3 , 8 , 2 4 , 7 2 h ( 每个时间点各8只) 用5 0 m 酬m L 苯巴比妥 0 . 2 一0 . 3 m L腹腔注射麻醉, 暴露心脏后经左心室 灌注5 %副醛一 磷酸盐缓冲液( 0 .
21、 1 m o V L p H 7 . 2 ) 5 m i n , 分离取脑并在上述灌注缓冲液中4浸润固 定2 4 h , 经过等级乙醇和二甲苯脱水后进行石蜡包 埋, 冠状切片厚度为5R m , 用于免疫组织化学分析。 空白 对照组动物( 生后第9 , 1 2 天各6 只) 标本的制 备同上。 1 . 3 免疫组化染色 组织切 片经过 固定及 脱 石蜡处 理后在 1 0 m m o l/ L p H 6 . 0 拘椽酸盐缓冲液煮沸1 0 m i n , 冷 却后用P B S 洗涤, 以4 %马正常血清阻断非特异性 反应3 0 m i n , 与抗 p 5 3 单克隆抗体( S i g m a ,
22、 1 0 m 梦 m l , ) 或抗M A P - 2 单克隆抗体( S i g m a , 2 m 岁m L ) 4 过夜孵育, P B S 洗涤后与生物素标记的马抗鼠二抗 ( V e c t o r , 2 m 留m l , ) 室温孵育6 0 m i n , 3 % H 2 0 2 阻内 源性过氧化物酶5 m i n , 显色用A B C E l i t e 试剂盒 ( V e c t o r ) 及 0 . 5 m 留m L二氨基联苯胺( D A B ) , 1 5 m 岁m L 硫酸镍胺,2 m g / m L R - D 一 葡萄糖, 0 . 4 m 岁m L N H , C 1
23、 和0 . 0 1 m 扩m L b 一 葡萄糖氧化酶 ( S i g m a ) 。 1 . 4 细胞计数 免疫组化用 N i k o n 光学显微镜观察, 分别计数 大脑皮层、 海马C A I 及纹状体的p 5 3阳性细胞数, 其中在大脑皮层损伤区( M A P - 2阴性) 计数三个高 倍视野下( 4 0 x 1 0 ) p 5 3 阳性细胞数, 取其平均值。 1 . 5 p 5 3 抑制剂( P F T - a ) 千预实验 1 . 5 . 1 方案一新生9日 龄 C 5 7 / B L 6小鼠分为 4 组, 每组8 只, 按照上述方法进行动脉结扎和缺氧 处理, 于缺氧后即刻分别用 1
24、 m 岁k g , 2 m 留k g , 8 m 酬 k g P F T - a ( 剂量的选择参照文献 6 ,7 略加改 动) 及0 . 5 %二甲亚矾( D M S O ) 腹腔注射。 1 . 5 . 2 方案二新生9日 龄C 5 7 / B L 6 小鼠分为 4 组, 每组7 一 8 只, 分别于缺氧前 1h 、 缺氧后即刻 及缺氧后I h 用2 m g / k g P F T - 。 腹腔注射, 对照组于 缺氧后即刻以0 . 5 %二甲亚矾( D M S O ) 腹腔注射。 上述动物于H I 处理后7 2 h 经灌注后取脑, 对脑损 伤程度进行评分。 1 . 6 脑损伤大体形态学评分标
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- 新生 小鼠 缺氧 缺血 P53 表达 及其 抑制剂 脑损伤 影响
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