新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR5的体外研究.pdf
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1、虫堡弛丝皇E 登送瘟登巍鍪盍f 垦! 地盟! 丛嬲! 瞧垡! 墅1 2 1 鲤! i 姒她 文章编号:1 6 7 1 - 2 8 9 7 ( 2 0 0 8 ) 0 7 - 4 8 5 一。毒 4 8 5 - 干细胞研究 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受 体C C R 5 的体外研究 丫鹏薛黎萍2 扬智勇王进昆1余化霖冯曜宇1冯忠堂3 +( 昆明医学院第 一附属医院神经外科,云南昆明6 5 0 0 3 2 ;2 云南省第二人民医院眼科,云南昆明6 5 0 0 2 1 ;3 昆明医学 腕神经科学研究所,嚣南昆明6 5 0 0 3 1 ) 摘要曩静探t 幸律乡 墙葬棒经予缁蕤慧否表这莛亿嚣予受
2、俸c c 瞄。方滚累鬻无蘸涛方法 分离、培养新生大鼠湃玛神经干细胞,细臌免疫荧光方法检测神经于细胞标志巢强融( n e s t i n ) 表达及 千细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力;后通过细胞免瘴荧光及逆反转录酶- 聚合酶链反应( R T - P C R ) 方法检测神经卡细胞表达趋化因子麓体C C K 5 的情况。结粜体外培养新嫩犬鼠海马神经干 细胞呈n e s t i n 阳性,可分纯为神经丝蛋自2 0 0 ( N F 2 0 0 ) 阳性神经党、胶质纤维酸性缀巍( G F A P ) 阳性星 彩获覆缨蕤及2 ,3 - 强孩蜚酸磷酸二醛酸( C N P ) 羯缝步突获璇缍稳,C C
3、R 5 缨憨受痰焚悫及R T P C R 诚实摊经于细胞表达趋亿因子受俸C C R 5 。结论掰生太簸海马神经予缩艟袭遮趋诧闵子受俸 C C R 5 ,为进一步研究麒体内、外迁移提供璁论依据。 关键词神经于缃胞;趋化因子;体外 中国图书资料分类号R3 2 9 2 + 8 文献标识码A I nv i t r os t u d yo ft h e 姆弦蜘o fe h e m o k i n er e c e p t o r 淄i nn e u l 瞪ls t e mc e l l so fn e o n a t a lr a t h i p p o c a m p u s D I N GP e n
4、 9 1 ,X U E 脚耐,Y A N GZ h i y o n 9 1 ,M cJ i r d a m ,H u a l i n ,F E N GY a o y u l ,F E N G 舶删耐 挑删删o f t m 獬,F i r s t 勘铋副虢删铲妊西皤M e d i c a lC o l l e g e ,K u n r m :n g6 5 0 0 弛;2 D e p a r t m e n t o f O p h t h a l m o l o g y ,S e c o n d 撇iH $ p i t a lo f Y n n n a n 两觑,题峨6 5 0 0 2 1 ;3
5、T h e I n s t i t u t eo f N e v m s e i e n c e , 赫喊M e d i c a lC o t t e g e ,r i m m i n g6 5 0 0 3 1 ,C h i n a A b s t r a c tO b j e c t i v eT oe x p l o r ew h e t h e rn e u r a ls t e mc e l l s ,i nv i t r o ,e x p r e s s e dc l m t 均k i n er e c e p t o rc c R 5 M e t h y l sT h en e u
6、 r a ls t e r nc e l l sw e f ei s o l a t e df r o mt h eh i p p o e a m p u so fn e o n a t a l 胁a n dc u l t u r e di ns o n m a - f r e e m e d i 眦U s i n gi m m m l o f l u r e s c e n c e t h en e u r a l + t e r nc e l l sa n di t sd i f f e r e n t i a t i o ni n t on e u r a la n dg l i a l
7、c e l lw e r e i d e n t i f i e d T h e n 抽睢掰l l I o 娃琢) r e s e 锄c ea n d 矬警e f s et r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) 硎e f e e m p l o y e dt od e t e c tw h e t h e rm u r a ls i e n ac e l l s 。i nv i t r o ,e x p r e s s e de h e n 瑚k i n er
8、e c e p t o r 筑弑5 。巍e 轴瞻T h e f l m t i n gn e u r a ls p h e r e s ,i s o l a t e df r o mn e o r m t a lh i p l x c a m p u s 。w e f en e s t i np o s i t i v ea n dc o u l dd i f f e r e n t i a t ei n t oc e l l s t oe x p r e s sc h a r a c t e r i s t i ca n t i g e no fn e u r o n s ,a s t r
9、o c y t e sa n d “黔量c n d r o c y t 姻I 删u o r e s c e n e ea n dR T - P C R s h o w e dt h a tt h en e u r a ls t e mc e i l se x p r e * tc h e m o k i n er e c e p t o rC C R 5 C o n c l u s i o nN e u r a ls i e mc e l l s ,i nv i t r o , e x p r e c h e m o k i n er e c e p t o rC C R 5 ,w h i c
10、 h 州d 措t h et h e o r e t i c a le v i d e r m ef o rf u r t h e rs t u d yo fi t sm i g r a t i o n 。 K e yw o r d sN e u r a ls t e mc e l l s ;C h e m o k i n e ;I nv i t r o 神经干细胞( n e u r a ls t e mc e i l s ,N S C s ) 是中枢神 经系统具有自我复制能力和多向分化潜能的一类细 作者篙介:丁瞒,博士,讲耀,毫谲:1 3 5 7 7 0 3 8 7 9 2 ,E - m 稿:
11、 p e n 刚w f m c 1 6 3 c o r n 。通讯作者:冯忠舷,教授,电话:1 3 7 0 8 8 6 0 1 2 5 ,E - m a i l :f e n g z t y n k m 磅1 6 3 c D m 胞,人们已经成功从胚胎及成年哺乳动物的室管膜下 层、纹状体、海强、小脑及脊髓等部位分离和培养出神 经手缍照。 露前研究诞实:中枢神经系统损伤后,宿主自身、 移植N S C s 可向损伤区迁移,参与中枢神经系统的礴 生修复。J ,假其具体机制还不十分清楚。I m i t o l a 和 R o b i n 等报道趋化因子基质细胞桁生因子1 q ( s t r o m a
12、 l 万方数据 4 8 6 c e l l d e r i v e df a c t r o 1 d ,S D F 1o L ) 通过与其受体C X C R 4 作用,诱导N S C s 向脑损伤区及缺血区迁移”“,参与 损伤修复;另W i d e r a 等证实趋化因子单核细胞趋化 蛋白- l ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n l ,M C P 一1 ) 通过与其受体C C R 2 作用,趋化N S C s 体外迁移p 。 我们先前的实验证实:F r a e t a l k i n e C X 3 C R
13、l 、S D F - 1 C x C R 4 及M C P 一1 C C R 2 通路体外可趋化骨髓摹质细 胞迁移“ 。在以上实验基础上,本研究拟通过体外 实验探讨体外培养N S C s 是否表达趋化因子受体 C C R 5 ,为进一步研究N S C s 的体内、外迁移提供理论 依据。 材料与方法 一、材料 新生5 7dW i s t a r 大鼠( 新加坡国立大学实验 动物中心提供) ,改良E 斟e 培养) 基F 1 2 ( d u l b e c c o ,s m o d i f i e dE a g l e ,sm e d i u m ,D M E M F 1 2 、D M E M F
14、12 ) 、 表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ,E G F ) 、碱性成 纤维细胞凶子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ,b F G F ) 、 胎牛血清购自G i b e o 公司,R N e a s yM i n iK i t 、逆转录 酶一聚合酶链反应( r e v e r et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ,R T P C R ) K i t
15、购自Q i a g e n 公司。 二、方法 1 大鼠N S C s 培养、鉴定:新生5 7dW i s t a r 大 鼠,无菌条件下分离头皮及颅骨,仔细剥离脑膜及皮 层后分离出海马,D - H a n k s 液漂洗,组织剪剪碎,加入 0 1 2 5 胰酶0 0 2 乙二胺四乙酸( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a e e t i ca c i d ,E D T A ) ,3 7 消化2 0m i n ,以含5 胎 牛血清( f e t a lb o v i n es e l u m ,F B S ) 的D M E M F 1 2 中止 反应,
16、经2 0 0 目筛网过滤,收集滤液。l0 0 0r m i n 离 心1 0m i n ,弃上清,加入D H a n k s 液洗涤、离心2 次。 以N S C s 完全培养液( D M E M F 1 2 培养液,含2 B 2 7 2 0n s m lb F G F 和2 0n s m lE G F ) 重悬细胞,细 胞计数后,以l 1 0 6 n i l 接种培养瓶,置于饱和湿度 下,5 C O :,3 7 。C 恒温培养箱培养。7d 形成原代细 胞克隆,1 0d 原代细胞克降生长较为密集,收集细胞 悬液,机械分离克隆制成单细胞悬液,10 0 0r m i n 离 心1 0r a i n
17、,弃上清,以N S C s 完全培养液进行传代培 养,以后每7 1 0d 传代一次。将N S C s 细胞克隆接 种多聚赖氨酸包被载玻片,固定、洗涤、封闭后,以小 鼠抗n e s t i n 单克隆抗体( 1 :2 0 0 ,C h e m i c o n ) ,4 孵 育过夜,空白对照以磷酸盐缓冲溶液( p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ,P B S ) 孵育过夜。P B S 洗三遍,以C y 3 结合的羊抗小鼠( 1 :2 0 0 ,C h e m i e o n ) 荧光二抗孵育l h ,P B S 洗三遍,荧光封片剂封片,O l
18、y m p u sB X S l 荧光 显微镜观察、拍照。 2 N S C s 多向分化能力检测:取传代培养N S C s , 以含血清培养( D M E M F 1 2 + 5 F B S ) 培养3d ,固 定、洗涤、封闭后,分别以小鼠抗神经丝蛋白2 0 0 ( n e u r o f i l a m e n t2 0 0 ,N F 2 0 0 ) 单克隆抗体( 1 :2 0 0 , S i g m a ) 、小鼠胶质纤维酸性蛋白( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i c p r o t e i n ,G F A P ) 单克隆抗体( 1 :8 0
19、0 ,C h e m i c o n ) 及小 鼠抗2 ,3 一环核苷酸磷酸二酯酶( 2 ,3 - c y c l i cn u c l e o t i d e 3 p h o s p h o d i e s t e r a s e ,C N P ) 单克隆抗体( 1 :2 0 0 , C h e m i c o n ) 孵育过夜,空白对照以P B S 孵育过夜。以 c y 3 结合的羊抗小鼠( 1 :2 0 0 ,C h e m i c o n ) 荧光二抗 孵育1h ,P B S 洗三遍,荧光封片剂封片,O l y m p u s B X 5 1 荧光显微镜观察、拍照。 3 N S C s
20、 趋化因子受体C C R 5 表达情况的检测 细胞免疫荧光检测:将N S C s 细胞克隆接种多聚 赖氨酸包被载玻片,多聚甲醛固定及标准血清封闭 后,以兔抗C C R 5 多克隆抗体( 1 :1 0 0 ,T o r r yp i n e s b i o l a b s ) 4 孵育过夜,空白对照以P B S 孵育过夜。 P B S 洗三遍,以C y 3 结合的羊抗兔荧光( 1 :2 0 0 , C h e m i c o n ) 二抗孵育1h ,P B S 洗三遍,荧光封片剂封 片。空白对照同上操作。O l y m p u sB X S l 荧光显微镜 观察、拍照。 R T P C R 检测
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