氢化可的松对大鼠脊髓星形胶质细胞体外分泌TNF-α及释放EAAS的影响.pdf
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1、文章编号:1 0 0 5 - 8 9 8 2 ( 2 0 0 4 ) 0 7 - 0 1 0 3 - 0 3 氢化可的松对大鼠脊髓星形胶质细胞体外 分泌 丁 N F - a及释放 E A A s 的影响 孙怡, 田玉科, 项红兵 ( 华中 科技大学同济医学院附 属同 济医院 麻醉教研室, 湖北 武汉 4 3 0 0 3 0 ) 摘要: 目的 观察氮 化可的 松对体外培养的大鼠奋髓星 形胶质细胞分泌T N F - 。及释放E A A s 的影响。 方法 体外纯 化培养大 鼠 奋 髓星 形胶质细 胞, 分为正常对照( C组) , L P S 终浓 度为0 . 1 m g / L ( L l 组)
2、; L P S 终 浓 度为1 m g / L ( L 2 组) ; L P S 终 浓 度为1 m g / L 及氮 化 可 的 松终 浓 度 为1 0 - m o l / L ( H C I 组) , L P S 终 浓 度为1 m g / L 及氮化可 的 松终浓 度为1 V m o l/ L ( H C 2 组) 。 分别 孵育。 , 1 和2 h 后取细 胞培养液, 应用 酶 联免疚分 析 方法( E L A S A ) 检测上清液中T N F - a的浓度; 用高效液相色 语仪测定各组培养细胞在。 , 1 和2 h 时谷氛酸 ( G l u ) 、 天门 冬 氮酸 柳 ) 的 释
3、放 .1o 结 果 在1 , 2 h 时, 与C 组 相比, L 1 , L 2 组T N F - 。分 泌 量, G lu , A s p 释 放量均显著升高( P 0 .0 5 和P 0 .0 5 a n d P 9 9 % 的星形 胶质细胞。 1 .2 实验分组 将纯性的 星形胶质细胞接种在2 4 孔培养板中, 每孔培养基 1 m l , 细胞密度3 x 1 0 0 / c m = , 待细胞长满 后, 将培养细胞分为5 组; C 组: 正常对照, 除培养基 外不加任何药物; L 1 和L 2 组: 在培养基中 加人脂多 糖( L P S ) , 浓度为。 . 1 m 妙 和1 m g
4、/ L ; H C l 和H C 2 组: 加人L P S ( 浓度为1 m g / L ) 及H C 浓度为1 ( 1 6 m o l / L 和1 0 5 m o l / L ) 。分别孵育0 , 1 和2 h 后每组取 3 孔培养液, 5 0 0 0 r / m i n 离心1 5 m i n 后取上清液。 1 . 3 酶联免疫方法测定 采用双抗夹心间接酶联免疫吸附法( e n - z y m e - li n k e d i m m u n o s o r h e n t a s s a y , E L I S A ) V J 定 T N F - a含量。 试剂盒购自 深A晶 美公司,
5、 由 专人严 格按照试剂盒说明书 进行操作。 1 .4 兴奋性氮基酸的测且 取细 胞培养液上清2 0 0 W L 加人4 倍量冰冷的 甲 醇, 混匀, 4 放置2 h 后, 4 0 0 0 0 r / m i n , 离心2 0 m i n , 取上清待测。 将2 7 m g O P A , 4 0 11 1 (3 一 疏基乙 醇溶于1 m l 甲醇中, 再加人4 m l 0 .2 m o l / L 的硼酸 缓冲液( p H 9 .5 ) , 室温下密封, 闭光保存, 静置9 。 。 后, 进样1 0 11 1 。 采用B i a n c h i L 。 改进的O P A柱前衍 生H P L
6、 C 荧光法检测突触体氨基酸含量方法,以峰 面积外标法定量。 1 .5 统计学处理 所有数据均用均值士 标准差 ( x 士 5 )表示, 用 S P S S 1 1 .5 统计软件包进行方差分析,用P o s t h o c L S D比 较来检验组内、 组间差异, 以P 0 .0 5 ) 。 在 1 , 2 h 时, 与C 组相比, L 1 , L 2 组T N F - 。分泌量均显著升高, 差异有显著 性( P 0 . 0 5 ) . H C 2 组 ( 氢化可的松浓度为1 0 - 5 m o l/ L ) 与 L 2 组的差异有显著性( P 0 .0 5 ) 。 H C l 和H C 2
7、 组两 个组之间比 较, 则在 1 , 2 h 时, H C 2 组的T N F - 。分 泌量均明 显低于H C l 组, 差异有显著性( P 0 . 0 5 ) 。 2 .2 各组在不同时间分泌的T N F - 。见附图。 C UL IM 组潮溯 UH(H( 胭.困口匹 120阴806040 啊物余巴己2白 0 1 2 T i m e ( h o u r ) 注: 1 ) 与C 组相比, P 0 .0 5 ;2 ) 与T 2 组相比, P 0 .0 5 3 ) 与H C 7 组相比, P 0 .0 5 附图 各组在不同时间 分泌的T N F - a比 较 2 . 3 各组细胞在不同时间内释
8、放的兴奋性氨基酸 量, 见表1 , 2 0 表, 各组细胞在不同时间内 谷氨酸t的变化 ( z 士 。 , w m o l / L ,h ) 分组0 1 2 5fgU ll L l 组 L 2 组 H 1 组 H2 组 3 . 9 5 2士 0 . 1 4 1 3 . 9 3 6土 0 . 1 0 4 4 . 0 2 0 t氏1 2 7 4 . 0 0 1土0 . 2 2 6 4 . 0 2 2 x 0 . 3 1 1 4 . 0 0 2士0 . 1 5 4 4 . 3 0 5士0 . 2 1 3 0 4 . 5 4 0 x 0 . 3 9 6 4 . 2 8 3土 0 . 2 7 5 n 4
9、1 2 1士0 . 3 5 2 4 . 0 1 5 t 0 . 3 1 2 4 . 5 8 4 t 0 .4 3 3 11 4 . 9 2 3士 0 . 2 5 6 0 4 . 5 0 3士 0 3 3 1 a 4 . 2 3 7士 0 . 2 3 5 a 注 1 ) 与C 组相比, P 0 . 0 5 2 与U 组比较. P 0 .0 5 1 0 4 万方数据 第, 期 孙 怡, 等: 氢化可的 松对 大鼠 脊髓星形 胶质细胞体外 分 泌I N F - 。及释 放E A A s 的影响 表2 各组细胞在不同时间内 天门 冬氮酸释放t的变化 ( x 土 。 , N . m o l/ L , h
10、 ) 分组0 1 2 C 组 L l 组 皿组 H 1 组 H 2 组 1 . 1 1 6士0 . 1 0 2 1 . 1 0 9 .0 . 1 1 4 1 . 1 2 5 x 0 . 0 9 6 1 . 2 0 6土0 . 2 8 5 1 . 1 2 6土0 . 1 2 5 1 . 2 2 1土0 . 1 3 6 1 .4 9 7 10 . 1 3 9 “ 1 . 6 6 4士0 . 1 0 5 “ 1 . 3 7 8 t 0 . 1 3 2 - 1 . 3 1 4 t 0 . 1 3 2 - 1 . 2 0 5士0 . 1 5 4 1 . 6 4 9士0 . 2 4 7 “ 1 .19 4
11、 5土0 . 3 1 6 “ 1 . 5 1 9 t 0 . 2 8 5 - 1 . 3 5 3士0 . 1 3 2 - 注: 1 ) 与C 组相比, P 0 .0 5 2 ) 与L 2 组比较, P 0 .0 5 与C 组相比, 在 1 , 2 h 时, L 1 , L 2 组的谷氨酸 ( g l u ta r u i c a c i d G lu ) 、 天门冬氨酸(a s p a ti c a c id A s p ) 释放量均明显增加, 差异具有显著性( P 0 .0 5 ) ; 又 L 2 , H ) , H 2 组具有相同的L P S 浓度, 故与L 2 组相 比, 在1 , 2
12、h 时, H I , H 2 组的G l u , A s p 释放量均明显 降 低, 差异具有显著性( P 0 . 0 5 ) 。 3 讨论 星形胶质细胞在疼痛中的作用是疼痛研究方面 新的进展。在疼痛传导中的主要部位一脊髓背角, A S T 被激活, 发生肥大、 增生, 释放大量化学物质如 神经递质、 神经营养因子、 细胞因子( I L - I , I L - 6 , T N F 等) 1 I , E A A s 等, 随 之在细胞因子、 E A A s 等的 作用下被激活, 引发瀑布式反应。在这个正反馈的 过程中, A S T的激活一释放细胞因子、 E A A s 是关 键。 中 枢神经系统
13、( C N S ) 中 作为神经递质的游离氨 基酸分为2 类, 具有兴奋作用的 谷氨酸( G l u ) 、 天门 冬氨酸 ( A s p )及具有抑制作用的y 一 氨基丁酸 ( G A B A ) 、 甘 氨酸( G l y ) 等, G lu 和A s p 是C N S 中 含 量高、 分布最广泛的E A A 类神经递质, 在痛觉信息 传递中 起着重要作用161 氢化可的松是皮质激素类药, 其具有广泛而强 大的 抗炎作用。 虽然其在疼痛治疗中 处于重要地位, 但其作用机制尚 不明了。 在本实验中, 我们以 脂多 糖( L P S ) 为刺激因子, 测定氢化可的松对激活的大 鼠 脊髓星形胶质
14、细胞分泌的T N F - 。的 影响, 结果 发现其明显抑制T N F - 。的分泌和E A A s 的释放, 即氢化可的松可以抑制细胞因子、 E A A s 对A S T 激 活的正反馈过程, 这说明氢化可的松可以通过抑制 脊髓背角的A S T 激活, 减少致痛化学物质的释放, 起到镇痛作用。 研究证实: L P S 及其他炎症因子通过细胞内 信 号传导途径, 迅速激活N F - K B 7 , N F - K B 是当前发 现的重要转录因子之一, 广泛参与多种细胞因子和 1 0 5 炎症介质的 基因 转录调控。 氢化可的 松抑制A S T 分 泌T N F - 。的机制可能通过活化的 糖皮
15、质激素受体 ( G - R) 进人细胞核与N F - K B的R e I A亚基直接偶 联而抑制N F - K B 与 K B 序列结合, 或通过糖皮质 激素反应元件( G R E ) , 上调N F - K B 抑制蛋白I K B 的表达等机制N F - K B的活化19 1。另外, 也有文献报 道: N O通过激活鸟昔酸环化酶( G C S ) 升高靶细胞 内c G M P 水平,即N O - c G M P 途径参与痛觉过敏19 1 而糖皮质激素能抑制培养细胞N O的 合成, 故氢化 可的松亦可能通过干扰N O 激活G C - S 等细胞内过 程而产生对炎性痛的镇痛作用。关于病理状态下
16、A S T 释放E A A的机制, 研究较少, 其可能是一个正 反馈的过程,即E A A通过促使N M D A受体依赖性 钙通道开放, 引 起胞外C a m 大量内 流, 激活i N O S 酶, N O 生成增加, 从而抑制能量代谢和N a “ - K - A T P 酶 的活性, 导致神经细胞去极化, 促进E A A的释放P o l o 氢化可的松抑制E A A的释放可能通过以下途径进 行, 即氢化可的松可以抑制N M D A受体pa阻滞电 压依从性C a 通道, 减少胞外C a “ 内流, 减轻胞外 N a “ 及细胞外钾的升高, 减缓或延缓神经终末性去 极化的发生。其确切机制尚需进一步
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