氨基胍对局灶性脑缺血大鼠线粒体损伤的影响.pdf
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1、Protective effect of omapatrilat on human umbilical vein endothelial cell injury induced by angiotensin in culture FENG Dan1, XU Jiang1, ZOU Jun2 (1. Dept of Physiology,Wuhan University School of Medicine, 2. Dept of Geriatric Research, Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071, China) Abst
2、ract: Aim To investigate the protective effects of omapatrilat on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)injury induced by angiotensin (Ang )in culture. Methods Cultured HUVECs were randomly divided into 4 groups: control;Ang; omapatrilat and Ang + omapatrilat. Lactate de- hydrogenase(LDH)le
3、akage was evaluated by spectro- photometer and cell cycle by flow cytometry(FCM) ; Nitric oxide(NO)was measured by colorimetry and endothelin-1(ET-1)by radioimmunoassay. Results 10 -7 mol L -1 Ang significantly increased LDH leakage and ET-1 release,and this increase was inhib- ited by omapatrilat(1
4、0 -6 mol L -1 ) .Omapatrilat promoted HUVECs proliferation and NO release. Con- clusion Omapatrilat can protect human umbilical vein endothelial cells injury induced by angiotensin in culture,suggesting that it may play an important role in prevention and treatment of vascular diseases. Key words: h
5、uman umbilical vein endothelial cells; Omapatrilat; Ang 氨基胍对局灶性脑缺血大鼠线粒体损伤的影响 李永辉,张建新,张会欣,李兰芳 (河北省医学科学院药物研究室,河北 石家庄 050021) 中国图书分类号: R-332; R 322. 81; R 329. 24; R 345. 44; R 743. 310. 53; R 977. 3 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1501 -04 摘要: 目的 观察选择性诱生型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍 (aminoguanidine, AG) 对局灶性脑缺血大
6、鼠脑线粒体损伤的 作用, 探讨其改善缺血性脑损伤的作用机制。方法 将大鼠 随机分为假手术组、 缺血对照组、 AG 治疗组, 采用线栓法复 制大鼠大脑中动脉栓塞 (MCAO) 模型, 分别于缺血后 2、 6、 12 h 给药治疗 3 d, 迅速断头取脑, 差速离心法提取缺血侧脑组 织线粒体, 测定线粒体总 ATP 酶、 超氧化物歧化酶 (SOD) 、 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性, 以及线粒体一氧化氮 (NO) 、 丙二醛 (MDA) 含量; 电镜观察了缺血后皮层神经元 超微结构的改变及 AG 对此改变的影响。结果 在大鼠 MCAO 后线粒体 NO 生成明显增加, 线粒体总 ATP
7、 酶、 SOD、 GSH-Px 活性均有明显下降, 线粒体 MDA 含量明显升高; 缺 血 2、 6、 12 h 给予 AG 治疗3 d 与缺血对照组相比 NO 生成有 所下降, 总 ATP 酶、 SOD、 GSH-Px 活性均升高, MDA 含量下 收稿日期: 2005 -07 -01, 修回日期: 2005 -09 -18 基金项目: 河北省自然科学基金资助项目 (No C2005000840) 作者简介: 李永辉 (1978 - ) , 男, 硕士生, Tel: 0311-6573207, E-mail: yonghui-li5 hotmail. com; 张建新 (1953 - ) ,
8、 男, 教授, 博士生导师, 研究方向: 心脑 血管 药 理, 通 讯 作 者, Tel: 0311-6573288, E-mail: jianx- inzhang3 hotmail. com 降。电镜结果显示脑缺血后皮层神经元水肿, 线粒体肿胀、 嵴断裂、 溶解、 消失, 且随缺血时间延长损伤加重; AG 能明显 改善脑缺血引起的神经元水肿、 线粒体肿胀和空泡化。结论 AG 能明显抑制脑缺血后线粒体 NO 生成, 改善线粒体能 量供应, 增加线粒体抗氧化作用, 从而减轻脑缺血损伤。 关键词: 脑缺血; 线粒体; 氨基胍; 超微结构 脑血管疾病严重威胁人类健康, 其中缺血性脑 损伤最为常见。临
9、床上治疗脑缺血是以溶栓为主, 但一部分病人在脑卒中后给予溶栓治疗, 其治疗效 果不十分理想。近年来, 国内外对脑缺血损伤机制 的研究表明, NO 参与了脑缺血损伤的发展, 并具有 双重作用。以往的实验证实, 应用选择性诱生型一 氧化氮合酶 (iNOS) 抑制剂氨基胍 (aminoguanidine, AG) , 对脑缺血损伤可产生明显的治疗作用 1, 2。 为了进一步探讨 iNOS 抑制剂对此损伤的保护作用 机制, 本实验观察了氨基胍对局灶性脑缺血大鼠脑 组织线粒体总 ATP 酶、 抗氧化酶活性、 脂质过氧化 水平、 线粒体 NO 生成, 以及对神经元超微结构的影 响。 1 材料和方法 1.
10、1 仪器设备 低温高速离心机 (CR21 型, 日立 1051中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) : 1501 4 公司) ; 722 分光光度计 (上海第三分析仪器厂) ; JA2003 型电子天平 (上海市精密科学仪器有限公 司) ; 恒温水浴箱 (余姚市东方电工仪器厂) ; 电子显 微镜 (H-7500 型 日立公司) 1. 2 药品与试剂 AG 购自 Sigma 公司; Ficoll 400, 美国 Pharmacia 公司分装; 甘露醇为日本分装; 丙二 醛 (MDA) 测定试剂盒、 超氧化物歧化酶 (
11、SOD) 测定 试剂盒、 超微量 ATP 酶测定试剂盒、 谷胱甘肽过氧 化物酶 (GSH-Px) 测定试剂盒、 一氧化氮 (NO) 测试 盒购自南京建成生物工程研究所; 其它试剂为国产 分析纯。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 动物分组与给药 健康 Wistar 大鼠 42 只, 体重 280 300 g (由河北省实验动物中心提 供) 。随机分为假手术 (sham) 组; 缺血 (ische- mia) 2、 6、 12 h 对照组; 缺血 2、 6、 12 h 给予 AG 治 疗 3 d 组, 每组 6 只。AG 治疗组按 100 mgkg -1腹 腔注射 (ip) 治疗 3 d, 每
12、天 2 次; 缺血对照组给等容 量生理盐水。 1. 3. 2 脑缺血模型制备 3 水合氯醛 350 mg kg -1腹腔麻醉大鼠, 采用 Zea-Longa 等线拴法, 建立 局灶性大脑中动脉栓塞 (MCAO) 模型。假手术组只 做颈部手术, 不插入尼龙线栓子。 1.3. 3 脑组织线粒体超微结构的观察 手术后相 应时间迅速断头取脑, 冰台上分离左侧大脑皮层, 沿 大脑中动脉中段取 1 mm3组织块, 立即以 4% 戊二 醛固定, 0. 1 molL -1 二甲砷酸缓冲液冲洗两遍, 1%四氧化锇固定, 再经缓冲液冲洗, 逐级丙酮脱水, 环氧树脂浸透, 包埋, 超薄切片, 醋酸铀-枸橼酸铅染 色
13、。透射电镜观察神经元线粒体超微结构的变化。 1.3. 4 脑组织线粒体的制备 4 采用改良的 Clark 技术, 按实验分组的预定时间断头, 迅速取出缺血侧 大脑半球, 按 1: 9 (W/ V) 加入带有冰渣的分离介质 (0. 025 molL -1 蔗糖, 0. 075 molL -1 甘露醇, 1 mmolL -1EDTA, pH 7. 4, Tris 调) , 玻璃匀浆器匀浆 (8 上 8 下) , 制成 10%的脑匀浆液。差速离心2 000 g 3 min, 取上清, 12 500 g 8 min, 留沉淀; 用 3% Ficoll 液 5 ml (3% Ficoll, 0. 12
14、molL -1蔗糖, 0. 03 mol L -1 甘露醇和 0. 025 mmol L -1 EDTA, pH 7. 4) 悬浮沉淀, 仔细分层入 6% Ficoll 液 10 ml (6% Ficoll, 0. 24 molL -1蔗糖, 0. 06 molL-1甘露醇和 0. 05 mmolL -1EDTA, pH 7. 4) , 10 400 g 离心 30 min; 沉淀用分离介质 5 ml 再次悬浮, 12 100 g 离 心 10 min 后得到的沉淀为提纯的线粒体。沉淀加 入 1 ml 分离介质制成线粒体悬液, 用考马斯亮蓝定 蛋白含量。 1. 3. 5 脑线粒体 NO 生成测
15、定 采用硝酸还原酶 法, 具体方法按试剂盒说明书进行。 1. 3. 6 总 ATP 酶测定 ATP 酶可分解 ATP 生成 ADP 及无机磷, 测定无机磷的量可判断 ATP 酶活力 的高低。ATP 酶活力单位以每小时分解每毫克组织 蛋白 (mg -1 Pro) 产生的无机磷 (Pi) 的含量 (mol) 来表示。具体方法按试剂盒说明书进行。 1. 3. 7 SOD、 GSH-Px 活性、 MDA 含量测定 具体 方法按试剂盒说明书进行。 1. 3. 8 统计学处理 实验数据以-x s 表示, 运用 SPSS11. 0 进行 One-Way ANOVA 及 Dunnetts 检验, 比较各组变量
16、间的差异。 2 结果 2. 1 AG 对脑缺血 2、 6、 12 h 后皮层神经元超微结 构的影响 假手术组大鼠皮层神经细胞核大而圆, 核膜清晰、 完整, 粗面内质网、 核糖体、 微管、 高尔基 复合体清晰可见, 线粒体双膜结构清晰, 嵴排列整 齐; 缺血 2 h 与假手术组相比可见神经元细胞轻度 水肿, 线粒体膜轻度肿胀、 部分嵴断裂; 缺血 6 h 神 经元细胞高度水肿, 线粒体膜高度肿胀、 嵴断裂、 消 失, 细胞器数量减少; 缺血 12 h 神经元细胞高度水 肿, 线粒体膜高度肿胀、 线粒体大量空泡化, 细胞器 数量明显减少等; 损伤程度随缺血时间延长明显加 重。与缺血组相比 AG 明
17、显减轻了脑缺血引起的神 经元超微结构改变 (Fig 1) 。 2. 2 AG 对 缺血 2、 6、 12 h 脑线粒体 NO 生成的影 响 缺血 2、 6、 12 h 脑线粒体 NO 生成明显增加, AG 治疗后 NO 含量明显降低 (Fig 2) 。 2. 3 AG 对缺血 2、 6、 12 h 脑线粒体总 ATP 酶、 SOD、 GSH-Px 活性、 MDA 含量的影响 缺血 2、 6、 12 h 脑线粒体总 ATP 酶、 SOD、 GSH-Px 活性明显低 于假手术组 (P 0. 05, P 0. 01) , MDA 含量高于假 手术组 (P 0. 05) ; AG 治疗组与缺血 2、
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