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1、水通道蛋白- 1, 3在豚鼠耳蜗及内淋巴囊的表达 李琦1 林琳1 胡吟燕1 黄德亮2 摘要 目的: 检测水通道蛋白(Ae P)- 1,3在豚鼠耳蜗及内淋巴囊中的表达情况。方法: 运用免疫组织化 学二步法及免疫荧光染色检测豚鼠耳蜗及内淋巴囊中Ae P - 1,3的表达。结果:Ae P - 1主要表达于耳蜗螺旋韧 带基底部、C o r t i器基底膜及鼓阶内侧上皮面及内淋巴囊上皮细胞下的基质组织中;Ae P - 3主要表达于血管纹、 螺 旋韧带、C o r t i器、 螺旋神经节细胞及内淋巴囊的上皮细胞及其下的基质成分中。结论:Ae P - 1, 3在豚鼠耳蜗及内 淋巴囊中存在广泛表达, 但其功能
2、仍未明确。 关键词 耳蜗; 内淋巴囊; 水通道蛋白 中图分类号R 3 9 2. 1 1 文献标志码 A 文章编号 1 0 0 1 - 1 7 8 1(2 0 0 5)2 3 - 1 0 8 5 - 0 3 E x p r e s s i o no fa q u a p o r i n - 1,3i nt h ec o c h l e aa n d e n d o l y m p h a t i c s a co fg u i n e ap i g L IQ i 1 L I NL i n1 HUY i n y a n1 HUANGD e l i a n g2 ( 1 I n s t i t u
3、t eo fO t o l a r y n g o l o g y,G e n e r a lH o s p i t a lo fP L A,B e i j i n g,1 0 0 8 5 3,C h i n a; 2D e p a r t m e n to f O t o l a r y n g o l o g y - H e a da n dN e c kS u r g e r y,G e n e r a lH o s p i t a l o fP L A) A b s t r a c t O b j e c t i v e:T od e t e c tt h ee x p r e s s
4、 i o no fA q u a p o r i n - 1,3i nt h ec o c h l e aa n de n d o l y m p h a t i cs a co f g u i n e ap i g . M e t h o d:T w o - s t e p i mm u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o da n di mm u n o f l u o r e s c e n c ew a su s e dt oe x a m i n et h ee x - p r e s s i o no fA q u a p o r i n
5、- 1,3. R e s u l t:A q u a p o r i n - 1w a se x p r e s s e do nt h eb a s i l a rp a r to fs p i r a l l i g a m e n t,b a s a lm e m - b r a n eo fC o r t i so r g a na n de p i t h e l i a l i so fs c a l at y m p a n i,a n db a s i l a rp a r tu n d e rt h ec e l l u l ae p i t h e l i a l i s
6、i ne n d o l y m - p h a t i cs a c .A q u a p o r i n - 3w a se x p r e s s e do ns t r i av a s c u l a r i s,s p i r a l l i g a m e n t,C o r t i so r g a n,s p i r a l g a n g l i o n a n d,t h e b a s i l a rp a r t a n dt h ec e l l u l ae p i t h e l i a l i si ne n d o l y m p h a t i cs a
7、c . C o n c l u s i o n:A q u a p o r i n - 1,3w e r ew i d e l ye x p r e s s e di n t h ec o c h l e aa n de n d o l y m p h a t i cs a co fg u i n e ap i g . K e yw o r d s C o c h l e a;E n d o l y m p h a t i cs a c;A q u a p o r i n 1解放军总医院耳鼻咽喉研究所( 北京, 1 0 0 8 5 3) 2解放军总医院耳鼻咽喉 -头颈外科 通讯作者: 黄德亮(
8、E m a i l:h u a n g d l 3 0 1y a h o o . c o m. c n) 水通道蛋白(a q u a p o r i n,Ae P) 是一组与水代 谢有关的通道蛋白, 目前已发现1 1个亚型, 分别命 名为Ae P0 - 1 0。在体内与水代谢密切相关的多种 组织及器官( 如肾脏, 心脏, 晶状体等) 均可发现其 不同亚型的表达。内耳存在内、 外淋巴2种液体, 其正常代谢与听力及平衡功能密切相关。为考察 豚鼠内耳Ae P表达情况, 我们对Ae P - 1, 3在耳蜗 及内淋巴囊处的表达情况进行检测。 1 材料与方法 1. 1 实验动物和药物 1 0只白色红目豚鼠
9、购自解放军总医院实验动 物中心, 体重3 0 04 0 0g, 雌雄不拘, 耳廓反射灵 敏, 电耳镜检测双侧鼓膜完整。麻醉药采用速眠新 ( 解放军军需大学畜牧研究所提供, 主要成分氟哌 啶醇、 新眠灵、 氯胺酮) 。兔抗鼠Ae P - 1及Ae P - 3 多克隆抗体购自C h e m i c o n公司, 免疫组织化学二 步法试剂盒及羊抗兔I g G(HlL) 荧光标记抗体购 自北京中杉生物制品公司。 1. 2 检测方法 以速眠新( 1m l/ k g ) 肌肉注射将动物麻醉, 麻 醉成功后, 开胸以0. 0 1m o l/LP B S及4%多聚甲 醛行心脏灌流。至头颈及双上肢完全僵硬后快速
10、 断头取双侧听泡。将听泡充分修剪, 保留耳蜗及内 淋巴囊部分, 4%多聚甲醛固定2 4h,1 0%E D TA溶 液脱钙1 0d( 常温) , 2 0%蔗糖溶液浸泡过夜,O C T 包埋过夜, 常规冷冻切片。 免疫组 织 化 学 (D A B) 染 色: 冷 冻 切 片 烤 片 6 0m i n后水洗去除O C T溶液,2%H2O2溶液阻断 内源性过氧化氢酶, 滴加Ae P - 1( 1i2 0 0) ,Ae P - 3 ( 1i1 0 0) 后3 7水浴2h, 多聚鳌合物( 二抗) 室温 孵育3 0m i n,D A B显色, 苏木精复染细胞核, 盐酸 乙醇分化后中性树胶封片。 免疫荧光染色
11、: 冷冻切片烤片6 0m i n,P B S T ( 0. 1%T r i t o n - P B S) 浸泡3 0m i n。阻滞液封闭, 室 温1h。滴加一抗后湿盒内孵育, 4过夜。室温下 P B S T漂洗1 0m i nh6。二抗为羊抗兔I g G(Hl L) 荧光标记抗体1i1 0 0,3 7温箱孵育6 0m i n。 P B S T洗5 m i nh3, 甘油封片。荧光显微镜观察。 2 结果 2. 1 Ae P - 1表达结果 免疫组织化学D A B法染色提示Ae P - 1主要 表达部位位于螺旋韧带基底部,C o r t i器基底膜及 鼓阶内侧上皮面。在内淋巴囊( 中间部) 其阳
12、性部 5801 临床耳鼻咽喉科杂志2 0 0 5年1 2月第1 9卷第2 3期 位位于上皮细胞下的基质组织中, 上皮细胞未见阳 性着色。免疫荧光染色部位与此相同。 2. 2 Ae P - 3表达结果 免疫组织化学D A B法染色提示,Ae P - 3主要 阳性部位位于血管纹及螺旋韧带全程, 尤以血管纹 处明显; C o r t i器上可见多处细胞染色; 螺旋神经节 细胞中亦可见阳性染色。在内淋巴囊 ( 中间部) Ae P - 3表现为广泛着色, 包括上皮细胞及其下的 基质成分。以上染色部位同样为免疫荧光所证实, 并且相对Ae P - 1而言, 无论是D A B染色还是荧 光,Ae P - 3在
13、耳蜗及内淋巴囊的着色强度均明显 低于Ae P - 1, 且范围较弥散( 图1, 2) 。 3 讨论 自Ae P发现以来, 针对其各种亚型在与水代 谢有关的器官、 组织中的表达情况文献屡有报道。 在耳科学领域, 由于梅尼埃病的病理基础已被证明 为内淋巴积水, 因此, 一直设想在耳蜗及内淋巴囊 处可能存在某些与水代谢障碍有关的机制。有鉴 于此, 近年来针对Ae P在耳蜗及内淋巴囊处表达 情况的文献较为多见 15。研究的动物一般以大 鼠及小 鼠 为 主, 针 对 豚 鼠 的 研 究 结 果 则 较 为 少 见 4,5。 Ae P - 1在内耳的螺旋韧带、 圆窗膜、 椭圆囊、 球囊及内淋巴 管、 内
14、淋 巴 囊 等 处 存 在 表 达 15。 S t a n k o v i c等 4在 成 年 豚 鼠 内 耳 的 研 究 中, 发 现 Ae P - 1在基底膜下的间充质细胞、 邻近骨迷路的成 纤维细胞、 螺旋韧带及接近鼓阶的间皮细胞呈强阳 性表达, 这与本实验结果所发现的阳性表达部位相 似。Z h o n g等 5在对花斑豚鼠研究中发现, Ae P - 1 分布于耳蜗血管纹, 螺旋韧带, 螺旋缘, 内沟细胞, 外沟细胞, 螺旋神经节, 前庭膜,C o r t i器的内、 外毛 细胞和支持细胞。在内淋巴囊Ae P - 1均匀表达于 上皮细胞及上皮下组织。由于花斑豚鼠耳蜗血管 纹中存在暗细胞,
15、 在免疫组织化学D A B染色过程 中, 暗细胞可能干扰染色结果的观察 6, 因此, 其研 究结果中发现的染色部位可能存在假阳性表达。 图1 a:Ae P - 1在耳蜗的表达 D A B染色 h2 0 0; 图1 b:Ae P - 3在耳蜗的表达 D A B染色 h2 0 0; 图1 c:Ae P - 1在耳蜗的表达 荧光染色 h2 0 0; 图1 d:Ae P - 3在耳蜗的表达 荧光染色 h2 0 0 图1 A Q P在耳蜗的表达 图2 a:Ae P - 1在内淋巴囊的表达 D A B染色 h2 0 0; 图2 b:Ae P - 3在内淋巴囊的表达 D A B染色 h2 0 0; 图2 c
16、:Ae P - 1在内淋巴囊的表达 荧光染色 h2 0 0; 图2 d:Ae P - 3在内淋巴囊的表达 荧光染色 h2 0 0 图2 A Q P在内淋巴囊的表达 6801 JC l i nO t o r h i n o l a r y n g o l(C h i n a) ,D e c2 0 0 5,V o l 1 9,N o2 3 为避免这种情况, 我们采用白色红目豚鼠, 结果显 示Ae P - 1在血管纹处无明显表达, 并且在内淋巴囊 处主要表达于上皮下基质组织中。提示Ae P - 1可 能主要参与维持骨质及基底膜结构的稳定性, 并且 由于其在C o r t i器基底膜及鼓阶内侧黏膜面出
17、现强 阳性表达, 提示可能参与外淋巴的代谢。 在所有已知的Ae P中,Ae P - 3是一种既参与 水的代谢, 又介导甘油代谢的蛋白。在Z h o n g等 5 的研究中发现Ae P - 3表达部位与Ae P - 1相似, 只 是在血管纹的表达强度上较Ae P - 1弱, 也较其他 区域的Ae P - 3弱。在内淋巴囊亦均匀表达于上皮 细胞及上皮下组织, 但强度亦较弱。在我们的实验 中, 发现Ae P - 3的表达部位与Z h o n g等的结果相 似, 但在血管纹中Ae P - 3表现为一种强染色, 这点 与Z h o n g等的恰好相反。造成这种差别的原因可 能与实验动物种属的不同有关。并
18、且我们的实验 中发现部分Ae P - 3染色阳性的细胞呈现均一类圆 形( 以免疫荧光所见为明显) , 因此不能排除其为细 胞核着色的可能。这一发现的解释是Ae P - 3可能 参与细胞内水的代谢, 因此在核膜或核内基质中存 在表达, 而导致在免疫组织化学实验中表现为细胞 核染色。这种假设需要对Ae P - 3表达部位的精确 定位( 如免疫荧光电镜实验) 的证实。 目前对于梅尼埃病的确切病因尚无定论, 由于 Ae P是已知的惟一与水代谢直接相关的通道蛋 白, 因此, 研究Ae P在内耳的定位及功能被认为是 了解梅尼埃病病理机制的一种有效手段。近来对 于内耳中Ae P的研究, 仍没有较为令人信服的
19、结 论。有鉴于此, 希望我们的工作能为早日解决这一 问题提供一定的参考作用。 参考文献 1B e i t zE,K u m a g a m iH,K r i p p e i t - D r e w sP,e ta l . E x - p r e s s i o np a t t e r no fa q u a p o r i nw a t e rc h a n n e l si nt h ei n - n e re a ro f t h er a t . T h em o l e c u l a rb a s i s f o raw a t e r r e g u - l a t i o ns
20、 y s t e mi nt h ee n d o l y m p h a t i cs a c . H e a rR e s,1 9 9 8, 1 3 2:7 6-8 4. 2H u m e sHD. I n s i g h t i n t oo t o o x i c i t y . A n a l o g i e s t on e p h - r o t o x i c t y . A n nNYA c a dS c i,1 9 9 9,8 8 4:1 5-1 8. 3 黄德亮.小鼠内耳水通道蛋白的定位及其意义.中华耳 鼻咽喉科杂志, 2 0 0 1,3 6(1) :7-9. 4S t
21、a n k o v i cK M,A d a m sJC,B r o w nD. I mm u n o l o c a l i z a - t i o no f a q u a p o r i nCH I Pi nt h eg u i n e ap i g i n n e re a r .Am JP h y s i o l,1 9 9 5,2 6 9:C 1 4 5 0-1 4 5 6. 5Z h o n gSk,L i uZ H.E x p r e s s i o no fa q u a p o r i n si nt h e c o c h l e aa n de n d o l y m
22、p h a t i cs a co fg u i n e ap i g .O R LJ O t o r h i n o l a r y n g o lR e l a tS p e c,2 0 0 3,6 5:2 8 4-2 8 9. 6 丁大连, 李明, 姜泗长, 主编.内耳形态学.哈尔滨: 黑龙 江科学技术出版社, 2 0 0 1. 7-7. ( 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 1 - 2 2) 沉痛悼念彭吉人教授 彭吉人教授, 中国共产党员, 我国知名耳鼻喉科专家, 因病救治无效, 于2 0 0 5年1 0月2 9日逝世, 享年 9 6岁。 彭吉人教授1 9 0 9年6月出生, 1 9
23、 3 5年毕业于华西协和大学八年制医科, 获华西协和大学和美国华盛顿 州立大学医学博士学位, 毕业后留校, 在耳鼻喉科从医执教。1 9 4 71 9 4 9年赴加拿大多伦多大学及坦伯尔 大学杰克逊喉外科、 内腔镜检科进修。曾任中华医学会耳鼻咽喉科分会常委, 中华耳鼻咽喉科杂志 编委, 中华医学会四川分会及成都分会耳鼻咽喉科学会主任委员, 中华医学会成都分会总负责人, 原华西协和大 学眼耳鼻喉医院( 存仁医院) 院长、 耳鼻喉科主任、 教授等职。发表学术论文数十篇, 并参加了 耳鼻咽喉科 全书 、 医学百科全书 耳鼻咽喉科部分条目的撰写工作。 彭吉人教授忠诚于党的教育和医疗卫生事业, 在数十年的教学、 医疗和科研工作中, 治学严谨, 精益求 精, 兢兢业业, 乐育英才, 严于律己, 为人师表。他的逝世是我国耳鼻喉科学界的一大损失, 也使我们失去了 一位良师益友, 我们表示沉痛的哀悼。 临床耳鼻咽喉科杂志 编辑部 2 0 0 5年1 1月 7801 临床耳鼻咽喉科杂志2 0 0 5年1 2月第1 9卷第2 3期
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