浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 0 7 - 0 5 7 0 - 0 4 浙江新分离汉坦病毒Z T 7 1株S基因片段的 克隆及序列分析 谢荣辉, 翁景清, 姚苹苹, 李婵, 徐芳, 朱函坪, 赵芝雅, 茅海燕, 朱智勇 摘要: 目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料, 研究汉坦病毒的进化状况及变异程度, 为疫苗病毒株 的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用R T - P C R方法扩增Z T 7 1株S基因片段并克隆入质粒载体, 进行核苷酸序列 测定及分析。结果 Z T 7 1株S基因由1 7 5 4个核苷酸组成, 只有一个开放读码框架, 共编码4
2、 2 9个氨基酸。与H T N型病毒 (7 6 - 1 1 8) 的核苷酸和氨基酸同源性分别为7 2 . 0 %和8 2 . 6 %, 与S E O型病毒 (S R- 1 1、 R 2 2、G u o 3、8 6 1 0) 核苷酸和氨基酸同源 性分别为8 8 . 4 %9 6 . 5 %和9 8 . 1 %9 9 . 0 %, 与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为S E O型汉坦病 毒, 为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。 关键词: 汉坦病毒; Z T 7 1株;S片段, 序列分析 中图分类号: R 3 7 3 文献标识码: A M e o l e c u l a r c
3、 l o n i n ga n dn u c l e t i d e s e q u e n c e a n a l y s i s o f t h eS s e g L e n t o f H a n t a n v i r u sZ T 7 1s t r a i n i s o l a t e d i nZ h e j i n a gp r o v i n c e X I ER o n g - h u i,WE N GJ i n g - q i n g,Y A OP i n g - p i n g,L IC h a n,X UF a n g,Z H UH a n g - p i n g Z
4、 H A OZ h i - y a,MA OH a i - y a n,Z H Uz h i - y o n g (Z h e j i a n gP r o v i n c i a lC e n t e r f o rD i s e a s eP r e v e n t i o na n dC o n t r o l, H a n g z h o u3 1 0 0 0 9,C h i n a) A B S T R A C T:T h eS s e g m e n t c D N Ao f h a n t a v i r u sZ T 7 1s t r a i nw a s o b s t a
5、i n e db y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o na n dp o l y m e r s e c h a i nr e a c - t i o n,s u b s e q u e n t l y c l o n e d i n t op G E M - Tv e t o r . T h e s e q u e n c e o f p o s i t i v e r e c o m b i n a n t sw a s d e t e r m i n e db y t h em e t h o do f d i d i o x yc h a i
6、 n t e r m i n a t i o n,w h i c h r e v e a l e d t h a t t h eS s e g e m e n tw a s 1 7 5 4n u c l e o t i d e i n l e n g t hw i t hao p e nr e a d i n g f r a m e e n c o d i n gap r o t e i no f 4 2 9 a m i n o a c i d s . T h e c o m p a r i s o nw i t hH T Nt y p e (7 6 - 1 1 8s t r a i n) i
7、 n d i c a t e d t h a t t h e r ew a s 7 2 . 0 %o f h o m o l o g g a t t h en u c l e o t i d e l e v e l a n d 8 2 . 6 %o f h o m o l o g y a t t h e a m i n o a c i d l e v e l . C o m p a r i s o nw i t hS E Ot y p e (S R - 1 1, R 2 2,G u o 3,8 6 1 0s t r a i n s)s h o w e d8 8 . 4 %9 6 . 5 % h
8、 o m o l o g ya t t h e n u c l e o t i d e l e v e l,9 8 . 1 %9 9 . 0 %h o m o l o g y a t t h e a m i n o a c i d l e v e l . T h e r e s u l t s o f n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d c o m p a r - i s o n s a tm o l e c u l a r l e v e l i n d i c a t e d t h a t Z T 7 1s t r a i n i s
9、S E OH a n t a n v i r u s . K E YWO R D S:H a n t a n v i r u s;Z T 7 1s t r a i n;Sg e n o m e s e g m e n t;s e q u e n c e a n a l y s i s 汉坦病毒 (H a n t a n v i r u s) 是引起肾综合征出血热 (H F R S) 的病原体, 属布尼亚病毒科, 其基因组由大 (L) 、 中 (M) 和小 (S) 3个基因片段的单股负链R N A 组成, 分别编码多聚酶、 外膜蛋白及核蛋白。汉坦病 毒目前可分为2 0型 亚型, 而且还不断有新的
10、型别或 亚型被发现 1 - 2 。在我国流行的主要是汉滩型 (H T N 型) 和汉城型 (S E O型) , 可引起肾综合征出血热 (H F R S) 。其中汉坦病毒的S基因片段所编码蛋白在 病毒感染及复制过程中具有重要的作用 3 , 而且S基 因片段具有相对的保守性, 进行序列分析及进化研究 对流行病学的调查具有举足轻重的意义, 可为疫苗毒 株的选择使用提供科学的依据。本文就2 0 0 3年浙江 新分离到的汉坦病毒Z T 7 1全S基因进行了测定及与 其它毒株进行比较, 探讨浙江分离株Z T 7 1与国内相 关病毒株的进化及变异情况。 1 材料与方法 1 .1 主要试剂 O n eT u
11、b eR T - P C R试剂盒购自 T a k a r a公司,R N A提取试剂盒式购Q i g e n公司,T a q 酶及质粒载体p G E M - T购自P r o m e g a公司, A g r o s e 割胶回收试剂盒购自上海博亚生物技术公司。 1 . 2 毒株来源汉坦病毒Z T7 1株由本实验室自 2 0 0 3年在浙江省天台县境内的褐家鼠肺组织中分 离, 病毒分离采用沙鼠腹腔接种法, 先将汉坦病毒抗 原阳性肺组织研磨制成悬液, 然后进行动物接种。 1 . 3 病毒R N A的制备将病毒接种到长满单层 作者单位: 浙江省疾病预防控制中心, 杭州 3 1 0 0 0 9 0
12、75 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5,2 1(7) 的V e r oE 6细胞瓶中, 接种71 4 d后, I F A检查细 胞感染程度。当7 5 %以上的细胞有感染病毒特异 性荧光颗粒时, 胰酶消化感染细胞, 并抽提总R N A. 1 . 4 引物的设计与合成 用D N A S T A R对汉坦病毒 S基因进行比对, 选择汉坦病毒S基因的保守区, 应 用此软件设计引物, 引物由上海生物工程有限公司 合成。设计的引物如下: F 1:5-T A G G A G C A - G A
13、C T C C C T A A A G A G C T A C T-3 ;R 1:5-C T G - G C C T A G T T G T A T C C C C A T T G A T TG-3 ;F 2:5 - T C A G A A G C A C A C A C A A T G G G R A T A C -3 ; R 2:5- A G A C G C A T G C T C C C T A A A A A G A - C A A T C- 3 。 1 . 5 S基因c D N A合成 由F 1和R 1扩增片段A, 由F 2和R 2扩增片段B .用O n eT u b eR T -
14、P C R试剂 盒一步法扩增。A片段的克隆方法具体方法如下: 总R N A1 2 u l, 酶混合物1 u l, R N A酶抑制剂1l, d N T P5l, 上F 1和R 1各1l,D T T2 . 5l, 无R N A 酶水2 6 . 5 l, 反应体系为5 0l。R T - P C R反应条件 如下: R T反应条件5 0 0 3m i n,P C R条件为:9 4 预变性2 m i n, 9 4 变性3 0 s,5 6 退火3 0 s,7 2 延伸 2 m i n,3 0次循环后,7 2 延伸7m i n。B片段克隆的 具体方法同上。 1 . 6 目的片段的克隆和筛选扩增产物A片段,
15、 B 片段割胶纯化回收, 连接反应按P r o m e g a提供的 P G E M - TE a s yV e c t o r克隆k i t说明书进行, 连接产 物转化D H 5 a感受态细胞, 并涂于含氨苄表霉素的 L B平板上, 筛选并鉴定阳性克隆。 1 . 7 c D N A序列的测定与分析 筛选的阳性克隆 经P C R鉴定, 然后进行序列测定, 用A B IP R I S M B i g - D y e测序试剂盒在A B I 3 7 7自动测序仪上进行 测序, 并用生物学软件D N A S T A R对其进行序列的 比较及分析。 2 结果 2 . 1 R T - P C R扩增产物的
16、检测 在琼脂糖凝胶电 泳中检查R T - P C R扩增产物, 产物分子量分别在1 2 0 0b p,6 0 0b p左右, 与期望的扩增片段相符, 无非 特异性条带出现, 表明特异性地扩增了目的基因。 2 . 2 Z T 7 1株S基因全序列的测定及分析Z T7 1 株S基因片段由1 7 5 4个核苷酸组成 (G e n B a n ka c - c e s s i o nA Y 7 5 0 1 7 1) , 由5N C R、 开放阅读框 (O R F) 和3 N C R3部分组成。与4株S E O型汉坦病毒 (S R- 1 1、 R 2 2、G u o 3、8 6 1 0) 的S片段同源性
17、分别为 9 6 . 1 %、9 6 . 2 %、8 8 . 4 %和9 6 . 5 %, 与H T N型7 6- 1 1 8的同源性为7 2 . 0 %, 与其它型汉坦病毒的同源 性较低 (见表1) 。序列分析表明Z T 7 1只有1个开 放读码框架, 起始密码子位于4 34 5个核苷酸, 终 止密码子位于1 3 3 0 1 3 3 2位核苷酸, 共编码4 2 9个 氨基酸, 与S E O型汉坦病毒标准株R 2 2仅有4个氨 基酸的差异, 同源性高达9 9 %, 与H T N型汉坦病毒 标准株7 6-1 1 8和D O B型汉坦病毒的氨基酸同源 性分别只有8 2 . 6 %和8 0 . 7 %
18、, 而与其它型别的汉坦 病毒氨基酸同源性更低, 见表1。 表1 Z T 7 1株与其它汉坦病毒型 (株) 之间S片段核苷酸和氨基酸序列的同源性比较 T a b l e . 1 C o L p a r i s o no f a L i n oa c i d s e q u e n c e ( t o p ) o fNp r o t e i na n d t h en u c l e o t i d e s e q u e n c e (b o t t o L)o f S s e g L e n t o f t h eZ T 7 1a n d o t h e rk n o w nh a n t a
19、 n v i r u s v i r u s s t r a i n7 6 - 1 1 8B A Y B C C D O B 8 6 1 0 K B R MO N MU LN YP U UR 2 2 S R - 1 1Z T 7 1I V E L M C G u o 3P HR O I S T O PS N 7 6 - 1 1 8* 6 3 . 4 6 3 . 6 8 2 . 3 8 2 . 8 6 1 . 9 6 2 . 5 6 2 . 2 6 2 . 7 6 1 . 4 8 2 . 8 8 2 . 8 8 2 . 6 6 2 . 3 6 1 . 5 8 2 . 6 6 1 . 6 6 1
20、. 86 36 1 . 8 B A Y5 9 . 1 * 9 2 . 1 6 2 . 5 6 2 . 7 7 3 . 4 8 8 . 1 9 2 . 5 8 7 . 47 36 2 . 5 6 2 . 5 6 2 . 5 7 5 . 8 8 4 . 4 6 2 . 7 7 6 . 5 8 3 . 4 7 4 . 18 6 B C C5 8 . 8 7 6 . 8 * 6 2 . 7 6 3 . 4 7 3 . 9 8 5 . 89 08 5 . 3 7 3 . 9 6 3 . 2 6 3 . 2 6 3 . 27 68 3 . 2 6 3 . 2 7 6 . 2 8 1 . 8 7 4 . 8
21、 8 3 . 2 D O B7 3 . 0 5 9 . 0 5 8 . 6 * 8 0 . 7 6 0 . 7 6 2 . 76 26 2 . 9 6 1 . 2 8 0 . 7 8 0 . 7 8 0 . 7 6 1 . 4 6 1 . 5 8 0 . 5 6 1 . 6 6 1 . 1 6 1 . 2 6 1 . 8 8 6 1 07 2 . 0 5 6 . 9 5 8 . 9 7 1 . 2 * 6 2 . 1 6 2 . 2 6 1 . 5 6 2 . 9 6 2 . 6 9 8 . 8 9 8 . 8 9 9 . 0 6 3 . 3 6 1 . 3 9 8 . 4 6 2 . 8 6
22、 0 . 86 36 1 . 5 K B R5 8 . 4 6 3 . 1 6 2 . 6 5 8 . 8 5 9 . 4 * 7 1 . 17 27 1 . 8 8 7 . 1 6 1 . 9 6 1 . 9 6 1 . 9 8 0 . 9 7 0 . 9 6 1 . 68 27 1 . 6 9 5 . 4 7 0 . 6 MO N5 8 . 4 6 6 . 0 6 5 . 3 5 7 . 5 5 7 . 1 6 1 . 5 * 8 3 . 49 67 0 . 66 26 26 27 5 . 3 8 4 . 1 6 2 . 2 7 4 . 6 8 2 . 3 7 1 . 69 3 MU L5
23、 8 . 1 7 4 . 1 7 4 . 3 5 8 . 3 5 8 . 4 6 4 . 0 6 5 . 6 * 8 3 . 47 36 1 . 1 6 1 . 1 6 1 . 1 7 5 . 8 8 2 . 5 6 1 . 1 7 4 . 8 8 0 . 97 38 2 . 1 N Y5 7 . 0 6 6 . 3 6 4 . 9 5 7 . 8 5 8 . 4 6 2 . 0 8 1 . 8 6 6 . 0 * 7 1 . 6 6 2 . 7 6 2 . 7 6 2 . 7 7 6 . 2 8 4 . 1 6 2 . 9 7 4 . 8 8 2 . 8 7 2 . 3 9 2 . 8 P
24、U U5 8 . 6 6 3 . 0 6 3 . 5 5 9 . 1 5 8 . 6 7 2 . 6 6 1 . 6 6 3 . 7 6 2 . 8 * 6 2 . 3 6 2 . 3 6 2 . 3 8 0 . 4 6 9 . 9 6 1 . 9 7 9 . 3 7 1 . 3 8 6 . 9 7 0 . 2 R 2 27 2 . 3 5 6 . 6 5 8 . 7 7 1 . 2 9 8 . 9 5 9 . 3 5 7 . 0 5 8 . 4 5 8 . 4 5 8 . 7 * 9 9 . 8 9 9 . 0 6 2 . 8 6 1 . 1 9 8 . 4 6 2 . 6 6 0 . 4
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