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1、毒理与检验 液相色谱荧光法测定鸡蛋中喹诺酮类药物残留 李莉,陈蓓 ( 江苏省疾病预防控制中心,江苏南京2 1 0 0 0 9 ) 【文献标识码】B【中图分类号】R 一3 3 1【文章编号】1 0 0 6 9 0 7 0 ( 2 0 0 8 ) 0 2 一0 0 6 4 一0 3 【关键词】喹诺酮类药物;残留;鸡蛋;高效液相色谱 喹诺酮类药物具有抗菌谱广、抗菌作用强、使用 方便、价格相对较低等优点,自1 9 7 8 年问世以来,临 床上广泛应用于治疗感染性疾病。后来,该药又扩 大应用到养殖业上,用来预防和治疗动物的细菌性 感染。喹诺酮类药物由于代谢缓慢,容易残留于肌 肉、肝脏、肾脏等机体组织内
2、j 。动物体内残留的喹 诺酮类药物对消费者构成潜在危害,除了引起过敏 反应外,还会对中枢神经系统产生副作用。消费者 如果经常食用这些动物源产品,还会导致对抗生素 产生耐药性。因此我国国家质监总局规定诺氟沙 星、恩诺沙星在动物肌肉、肝脏和肾脏中的M R L 值 分别为1 0 0 、2 0 0 、3 0 0t x g k g 。欧盟则规定恩诺沙星 与环丙沙星在动物肌肉、肝脏和肾脏中的最大残留 量之和分别为1 0 0 、2 0 0 或3 0 0 - g k g ,而美国则禁 止喹诺酮类药物应用于动物源性食品。据文献报 道,喹诺酮类药物的检测有微生物法、毛细管电泳 法、高效液相色谱法和L C - M
3、S 法 z 叫1 ;微生物法一 般用来检测药物制剂含量,毛细管电泳法检测灵敏 度较低( 最低检出限在0 5m g k g ) ,不能满足M R L 值的要求。而高效液相色谱荧光检测法具有快速、 准确、灵敏度高的特点,适用于动物源食品中喹诺酮 类药物残留量的测定。本研究在2 0 0 6 年农业部 7 8 1 号公告方法的基础上。改进了样品前处理步骤 和色谱分离条件,建立了同时分离诺氟沙星、环丙沙 星、恩诺沙星的测定方法。 , 1 材料与方法 1 1 仪器与试剂仪器:A g i l l e n tH P1 1 0 0 型高效 液相色谱仪;G 1 3 1 3 A 型荧光检测器;B u c h i 旋
4、转蒸 发仪;离心机。试剂:乙腈( H P L C 级) 、正己烷( 分析 纯) 、磷酸( 分析纯) 、三乙胺( 分析纯) 、盐酸( 分析 纯) 、无水硫酸钠( 分析纯) 、氢氧化钠( 分析纯) 、酸化 收稿日期:2 0 0 8 一0 2 2 8 作者简介:李莉( 1 9 5 8 一) ,女,江苏如东人,副主任技师。 乙腈;0 0 5m o l I 。磷酸三乙胺溶液( p H 2 4 ) :取磷 酸3 4m l ,加水稀释至l0 0 0m l ,于p H 计上滴加三 乙胺调p H 至2 4 ;诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星 标准储备液:精密称取诺氟沙星( 9 9 o0 4 ) 、环丙沙星 ( 8
5、4 9 ) 、恩诺沙星( 9 8 0 ) 1 0m g ,分别置于3 个 5 0m l 棕色容量瓶中,加入0 0 3m o l L 氢氧化钠溶 液溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为 0 2m g m l 的储备液,置4 冰箱保存,有效期为 3 个月。诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准工作 液:分别吸取上述标准储备液1m l ,置于同一1 0 0 m l 棕色容量瓶中,用流动相稀释并定容至刻度,配 制浓度为2t - g m l 的标准工作液;再吸取该标准工 作液l om l 于1 0 0m l 棕色容量瓶中,用流动相稀释 并定容至刻度,配制浓度为0 2t 生g m l 的标准工作 液。 1 2
6、实验方法 ( 1 ) 仪器条件:色谱柱,Z o r b a xS Bf C 1 8 2 5 0m m 4 6r i l n l ,5 “m ;流动相,0 0 5m o l L 磷 酸三乙胺溶液( p H 2 4 ) :乙腈( 8 4 :1 6 ) ;流速, 1 0m l m i n ;检测波长,激发波长2 8 0n m ,发射波长 4 5 0n m : ( 2 ) 样品制备:取适量鸡蛋,将蛋清和蛋黄搅拌 均匀。一2 0 冰箱中储存备用。 ( 3 ) 样品提取与净化:准确称取5 0g ( 精确到 0 0 0 1 g ) 制备好的样品于1 5 0m l 具塞三角烧瓶中, 先加入3 0g 无水硫酸钠
7、,混匀。再加入3 0m l 酸化 乙腈,用玻棒将颗粒研碎,摇床振摇1 5m i n 后,上清 液转入2 5 0m 1 分液漏斗中,残渣中再加3 0m l 酸化 乙腈,重复上述操作,合并上清液于同一分液漏斗 中,加入2 5m l 水饱和的正己烷,充分振摇2m i n ,静 置分层后,取下层液,移入1 0 0m l 圆底烧瓶,5 5 万方数据 婆菱夔堕匡堂;! ! ! 生! 旦筮! ! 鲞筮! 塑迪监! ! 里! 型丛型! 坚1 2 1 1 ! y ! ! :! ! :垒坠; 旋转蒸发至干,用2 0m l 流动相溶解残渣,移入 1 5m l 离心管,90 0 0r r a i n 离心1 0r a
8、 i n ,取上清液, 经0 4 5 扯m 微孔滤膜过滤,滤液供液相色谱仪测 定。同时作试剂空白试验。 ( 4 ) 标准曲线制备:取适量诺氟沙星、环丙沙 星、恩诺沙星标准工作液,用流动相稀释成浓度为 0 0 0 5 、0 O l 、0 0 2 、0 1 0 、0 5 0 z g m l 的诺氟沙星、 盐酸环丙沙星、恩诺沙星标准溶液,分别进样2 0 肚L 进行液相色谱分析。 ( 5 ) 样品测定:取适量的试样溶液和相应的标 准工作液,做单点或多点校准,外标法定量。 2 结果与讨论 2 1 线性范围和最低检测限配制3 种药物标准 溶液浓度系列,3 天内重复测定3 次,得3 条标准曲 线。结果表明:
9、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星在2 5 5 0 0v g L 浓度范围内具有良好线性关系。按取 样量5 0g 定容至2 0m l 计算,诺氟沙星、盐酸环丙 6 5 沙星、恩诺沙星的最低检出限分别为1 0 t g k g 、 1 0 肛k g 、0 89 9 k g 。回归方程及相关系数见表1 。 裹l 标准曲线的回归方程及相关系数 2 2 精密度和加标回收率试验向鸡蛋样品中添 加0 0 1 肛g 、0 1 弘g 两个浓度水平的3 种药物的混 合标准溶液,做加标回收试验,每个水平6 次试验结 果见表2 。 表2 精密度和回收率试验结果( n - - 6 l 2 3 阳性样品的平行试验准确称取同一阳
10、性样 品( 如环丙沙星) 3 份,按上述操作步骤进行测定,测 定值分别为1 3 2 、1 1 3 和1 5 2 弘g k g ,R S D 为 1 4 7 。 2 4 标准及样品的色谱图见图1 、图2 、图3 。 圈1 鸡蛋样品空白色谱围 7 图2 混合标准图谱 F I D I AE z 2 a OE m - 4 5 0 ( L U S X 、0 7 1 0 1 0 1 1D k 2 ;C P F X交 ik 美 O2 5575 1 0 1 251 51 75 J 1 1 1 I 图3 玛蛋阳性样品色谱图 2 5 样品前处理方法的优化在采用2 0 0 6 年农业 部7 8 1 号公告方法提取步
11、骤时发现,即使采用90 0 0 r m i n 离心,提取液始终是粘稠的胶体溶液,无法得 到澄清透明溶液,而扩大提取液的体积,会引起检测 灵敏度降低,故对原方法进行改进。现用的提取方 法,操作简便,回收率试验和阳性样品的平行试验结 果表明,不仅提高了检出灵敏度,能够将目标物与杂 质进行分离,并具有良好的分离度和重现性。 2 6 色谱条件的优化原方法中的色谱条件不能 测定诺氟沙星,经优化色谱条件,不断调整流动相的 比例后,使诺氟沙星与盐酸环丙沙星得到很好的分 离。另外,流动相的p H 值对化合物出峰的保留时 间有较大的影响,因此盛放流动相的瓶子应加塞密 闭,防止由于p H 值的变化而引起保留时间
12、的变化。 万方数据 6 6 如果测定的样品较多,样品间需用标准进行校正。 2 7 确证试验对上述鸡蛋中环丙沙星检出阳性 的样品,在L C M S 上进行了确证试验,定性结果 为阳性。 3 结论 本文建立的方法适用于鸡蛋中喹诺酮类药物残 留量的测定,尤其适用于定量测定。在样品多的情 况下,可以先采用高效液相色谱法对样品进行测定, 阳性样品再在液质上进行确认,既可节约运行成本, 又可保证结果的准确性。 参考文献 1 张德云、李孟波、彭之见高效液相色谱法测定鱼肉中4 种喹诺 酮类药物E J 中国卫生检验杂志。2 0 0 5 1 5 ( 5 ) :5 2 6 5 2 7 E 2 3 L i s i a
13、 n ed aS i l v e i r aE v E l f f i d e sE sS c h a p o v a l M i c r o b i o l o g i c a la s s a yf o rd e t e r m i n a t i o no fo f l o x a c i ni n j e c t i o n J J o u r n a lo f P h a r m a c e u t i c a la n dB i o m e d i c a lA n a l y s i s 2 0 0 2 :9 1 9 6 3 3 尹茶,吴,t 田高效毛细管电泳法同时测定4 种喹诺
14、酮类药物 J 药物分析杂志,1 9 9 7 ,1 7 ( 6 ) :3 7 1 3 7 3 4 余以刚刘继平喹诺酮类药物残留色谱研究概述 J 中国卫 生检验杂志,2 0 0 6 ,1 3 ( 4 ) :4 0 9 - 4 1 0 毒理与检验 吐温- - 8 0 增敏光度法测定卷烟纸中磷酸盐含量 林仁权,厉志玉,胡文兰 ( 杭州市拱墅区疾病预防控制中心,浙江杭州 3 1 0 0 1 1 ) 【文献标识码】B【中图分类号】R 一3 3 1【文章编号】 1 0 0 6 - - 9 0 7 0 ( 2 0 0 8 ) 0 2 - - 0 0 6 6 - - 0 2 【关键词】分光光度法;磷酸盐;吐温-
15、 - 8 0 ;卷烟纸 高档卷烟纸通常通过填加磷酸盐( 磷酸氢二钠 或磷酸二氢铵) 来改善烟支燃烧状态。目前测定磷 酸盐的方法主要是磷钼蓝法和钒一钼酸铵法。本文 尝试采用吐温一8 0 增敏光度法来定量测定卷烟纸 中的磷酸盐,现报告如下。 1 材料与方法 1 1 材料仪器:7 2 2 型可见分光光度计。试剂:吐 温一8 0 ,1 ( 体积分数) 1 0m l 吐温一8 0 加水至 1 0 0m l 。磷酸盐( P ( ) i 一) 标准溶液,按国标法配制成 1 0m g m l 储备液,临用时用水稀释成1 0 og g m l 的 工作液。钼酸铵溶液,称取2 5g 钼酸铵溶于3 0 0r I l
16、 l 水 中,再加7 5 ( 体积分数) 硫酸溶液至5 0 0m l 。 1 2 方法 ( 1 ) 绘制标准曲线:取两支相同的2 5m l 比色 管,分别加入2 5r 1 1 l 吐温- - 8 0 溶液和2r 1 1 l 钼酸铵溶 液,其中1 支再加入适量磷酸盐标准溶液工作液,分 别混匀,稀释至刻度,放置1 0m i n 。以试剂空白作对 照,用2c i n 比色皿,于波长4 0 0n l T l 处测定吸光度,以 磷酸盐标准溶液浓度与吸光值A 制作工作曲线。 ( 2 ) 样品的测定:称取碎纸样1g 置于2 5 0m l 收稿日期:2 0 0 8 0 3 1 3 作者简介:林仁权( 1 9
17、7 5 一) 男福建永泰人,主管技师。 锥形瓶中,加入5 0m l0 5m o l lL 硫酸溶液。室温 下振荡2 0m i n 后过滤,将滤液于1 0 0m l 容量瓶中 定容,摇匀。- 吸取1 0 0m l 此溶液于2 5m l 比色管 中,再按( 1 ) 方法操作。 t 2 结果 2 1 实验条件的选择 ( 1 ) 吸收波长:取4 弘g m l 标准管,按本法于波 长3 8 0 4 3 0n m 处测定吸光度值,被测体系在波长 4 0 0a m 处最为稳定。故选用4 0 0n m 为测量波长。 ( 2 ) 硫酸用量:因本试验宜在酸性条件下进行, 分别用磷酸、硫酸和盐酸进行试验,以硫酸效果最 好。进一步试验,3 0 硫酸用量在0 5 2 0m l ,氢 离子浓度在0 8 1 2m o l L 时吸光度稳定。本文 选用2 0m l ,并与钼酸铵溶液一起加入。 ( 3 ) 试剂用量:分别试验了O P 一1 0 、C T M A B 和吐温- - 8 0 等多种表面活性剂对显色体系的影响, 结果表明,加入吐温一8 0 后,显色反应迅速完成,且 稳定时间达4h ,有明显的增稳作用。其增敏机理 是在硫酸介质中,磷与适量的钼酸根形成磷钼杂多 酸,在非离子表面活性剂( 吐温- - 8 0 ) 存在下,形成微 万方数据
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