激活蛋白2对HELA细胞中SURVIVIN的抑制作用.pdf
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1、6 0 4 激活蛋白一2 对H e l a 细胞中s u r v i v i n 的抑制作用 张梦杰杨云龙孙明廖雅成黄力维李风知 【摘要l目的探讨激活蛋白一2 ( A P 一2 ) 对H e h 细胞中s u n r i v i n 基因表达的影响,为靶向抑制s u r v i v i n 基 因表达的肿瘤治疗奠定理论和临床应用基础。方法共转染s u r v i v i n 启动子一荧光素酶报告基因质粒和A P - 2 。双 荧光素酶活性检测A P - 2 对s u r v i v i n 启动子活性的影响;转染A P 一2 到H e l a 细胞中,反转录一聚合酶链反应( R T P c R
2、 ) 和w e s t e m b l o t 检测A P - 2 对H e l a 细胞中明n ,i v i n 基因表达的影响。结果A P _ 2 能抑制s u r v i v i n 核心启动子 活性:并在转录和翻译水平上抑制H e h 细胞中的s u r v i v i n 基因表达。结论A P - 2 可抑制H e l a 细胞中s u n r i v i n 基 因的表达,为有效控制蚰“i v i n 基因表达提供了薪的思路,为靶向s u r v i v i n 的肿瘤基因治疗奠定基础。 【关键词】H e l a 细胞;s u r v i v i n ;A P 一2 ;转录因子 A
3、 砸v a t o rp t e i n _ 2 蛐i b i t s 辄r v i v i I I 寥耻麟p r 哪i o ni nH e I ac e 脚A c 胁,州如, l ,A l ,u n 一肠n g s E , M 够MDl ,口叼7 地哆H 珊M i 吲e L ,屁,l g - 名舰唧e n 如6 0 r 咖,y 矿肘诎zO ,苫狮厶m 死c 加如彩s c 如o Z 矿扣 s c 曲眦e s d 死c n 0 o 盯,凡威面e 那n y ,鼽佣加瓜2 0 0 0 9 2 ,C h i n a 【A b s t 哺c t 】O b j e c t i v eT 0e l u c
4、i d a t et h ei m p a c t so fa c t i v a t o rp m t e i n 一2 ( A P 一2 ) o n8 u r v i v i ng e n ee x p r e s 8 i o ni n H e l ac e U 8a n dt op r o v i c I e t l e o r e t i c a la I l dc l i n i c a lb a s i s b rt a 船e t e ds u p p r e 鹳i o no fs u r v i v i n # r e n e M e t h o d sT h es u r v
5、i v i np r o m o t e ra n dA P 一2w e r ec o t 啪s f e c t e di n t oH e l ac e U st 0d e t e c tt h ei m p a c t so fA P 一2o na c t i v i t i e so fs u n r i v i np m m o t e r 1 - I l e 吲班l “o ft h es u r v i v i ne x p r e 够i o nb yA P 一2w a sd e t e c t e d 试也R T P C Ra n dW e s t e mb I o t t i 醒
6、a f t e rt r a 璐。 f e c t i o n R 酬t sA P 一2w a ss h o w nt oi n h i b i tt h e 舵t i v i t yo fs u i v i nc o r ep r o m o t e ri nH e l ac e U s I na d d i t i 仰,A P 一2a 1 s oi n h i b i t e dg u r v i v i ne x p 残I s s i o na tm et 瑚m s c I i p t i o n 蛳dt r a n 8 l a t i o nl e v e l si nH e l ac
7、 e l l s C o n c I u s i o nI 州蚯h i t i o no fs u r v i v i ne x p r e 8 s i o ni nH e l ac e u sb yA P 一2m a yo p e nu pan e w 印p m a c hf o re 娲c t i V er e g L I l a t i o no fs u n r i v i ng e n e 种dp m 、i d eap 吐e 以a lb a s ef o r 马u r v i v i n 一_ 【a r g e t e dc a n c e rt h e r a p y 【K e y
8、w o r d s 】 H e l ac e U s ;S u n r i v i n ;A P - 2 ;T r 柚s c r i p t i o n 蠡l c t o r S u r v i v i n 是细胞凋亡抑制蛋白家族中最重要成 员之一它在几乎所有癌细胞中高表达,而在正常组 织中不表达或者只在少数组织细胞中很低表达【1 1 。 S u r v i v i n 蛋白是一种双功能蛋白,不仅可以促进细胞 分裂而且能抑制细胞的凋亡 :t 3 。转录因子激活蛋白 ( A P ) 一2 在基因表达调控、胚胎发育和抑制肿瘤发生 中起重要作用。研究发现A P 一2 在某些肿瘤发生过 程中起调节作用
9、。能抑制人类某些肿瘤和癌细胞株 的生长 引。我们首次发现了转录因子A P 一2 能有效抑 制肿瘤细胞中鲫r v i v i n 基因的表达而对正常细胞 影响很小 1 引。本研究主要利用双荧光素酶活性检 测、反转录一聚合酶链反应( R T P C R ) 和w e s t e m b l o t 检测A P 一2 对H e l a 细胞中s u “i v i n 基因表达的影 响,为靶向抑制肿瘤细胞中的s u 九r i v i n 基因表达而 促进肿瘤细胞凋亡的肿瘤基因治疗奠定一定的理论 和临床应用基础。 l 材料与方法 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 3 0 7 0 1 0 1 4 )
10、作者单位:2 0 0 0 9 2 上海,同济大学生命科学与技术学院模式生物 技术开放实验室 1 1 材料:H e l a 细胞系由本实验室保存。A P 一2 表达 载体p R S V A P 一2 d 、p R S V 一2 p 、p R S V 一2 1 和p R S V N N 由美国r I I r e v o rW i l l i a m s 和H e l e nc H u r s t 博士惠赠。 S u r v i v i n 核心启动子一荧光素酶报告基因载体由本实 验构建。R P M l l 6 4 0 培养基购于H y c l o n e 公司;胎牛 血清购于复蒙基因生物科技有限公
11、司;L i p o f e c t a m i n e 心0 0 0 购于I n v i t r o g e n 公司;D a u l L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a yS y s t e m 购于P r o m e g a 公司;R T P C R 试剂盒购于T a k 锄公司;聚偏氟乙烯( P V D F ) 膜购 于B i o R a d 公司。 1 2 方法:H e l a 细胞培养:用含1 0 胎牛血清的 R P M I l 6 4 0 培养基5 二氧化碳条件下细胞培养箱 常规培养。 荧光素酶报告基因质粒的转染:按l i p o
12、f e c t i m i n e T M2 0 0 0 转染试剂盒( I n v i t r o g e n ) 说明进行转染,细 胞接种于9 6 孔板,每孔加O 1 5 斗gs u n r i v i n 启动子一 荧光素酶报告基因质粒p L u c 一2 3 0 、0 0 5 斗gA P 一2 仅 表达载体、内参照p R L T K 质粒0 0 l 嵋、脂质体 l i p o f e c t i m i n e l M2 0 0 00 5p 1 、无血清无抗生素1 0 4 0 培 基1 0 0 斗1 ,三复孔检测。 万方数据 荧光素酶活性测定:按双荧光素酶活性检测试 2 3W e s t
13、 e mb l o t 结果:见图3 。 剂盒( P r o m e g a ) 说明进行。 收集H e l a 细胞,磷酸盐缓冲液( P B S ) 冲洗2 次, 加入1 P L B 细胞裂解液1 5 l ,室温放置1 0I l l i n 后,吹打细胞,收集细胞裂解液。荧光测定管中加 1 0 0 斗lL A R ( L u c i f e m s ea s s a yr e a g e n t ) ,再加细胞 裂解液1 0 斗l ,放置发光仪中,测定荧光素酶活性;然 后再加入1 0 0 斗lS t o p & G l or e a g e n t ,测定内参照质 粒p R L T K 中的
14、R e n i l l a 荧光素酶活性。发光仪程序 设置:延迟2s ,测定时间l Os 。 R T P C R :H e l a 细胞铺2 4 孔板,l i p o f e c t i m i n e 喇 2 0 0 02 斗1 转染A P 一2 0 【和对照质粒,4 8h 后收集细 胞,进行R T P C R ,9 4 预变性4m i n 。9 4 变性4 5 s ,5 6 退火1m i n ,7 2 延伸4 58 ,7 2 终延伸1 0 m i n o S u r “v i n 弓l 物s e n s e :5 一C C C C A T A G A G G A A C A T A A A
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