激活血管内皮细胞非神经性M受体对不同亚型G蛋白基因表达的影响.pdf
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1、论 著 激活血管内皮细胞非神经性 M 受体对 不同亚型 G 蛋白基因表达的影响 陈 凯, 汪 海 (军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850) 收稿日期: 2006 -02 -11, 修回日期: 2006 -04 -03 基金项目: 国家重大基础研究发展规划 (973 规划) 资助项目 (No G1998051112) 作者简介: 陈 凯 (1975 - ) , 男, 博士, 助理研究员, 研究方向: 分子 心血 管药理学。Tel:010-66931557,Email:chenkai bbn. cn; 汪 海 (1963 - ) , 男, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方 向:
2、 分子心血管药理学, Tel:010-66932651,E-mail:wh nic. bmi. ac. cn 中国 图 书 分 类 号: R-332; R 284. 1; R 322. 12; R 329. 2; R 392. 11; R 394-33; R 394. 2; R 971. 9 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2006) 06 -0664 -04 摘要: 目的 研究 G 蛋白各亚型在内皮细胞上的表达分布, 以及氨甲酰胆碱和毛果芸香碱的调节作用。方法 培养大 鼠主动脉内皮细胞, 用氨甲酰胆碱和毛果芸香碱 10 -4mol L -1分别孵育, 6 h 后提取细胞
3、总 RNA, RT-PCR 方法测定 G 蛋白不同亚型 mRNA 的表达。结果 G 蛋白 4 个亚家族中 的 Gq/11 、 Gs、 Gi 在内皮细胞有表达, 而 G12/13 未见表达, 氨甲酰胆碱和毛果芸香碱分别作用 6 h 后, Gs、 Gi 家族、 Gq/ 11 家族中的 G11 蛋白基因表达均未发生变化, 只有 Gq/11 家族中的 Gq 蛋白在氨甲酰胆碱 10 -4 molL -1作用下, 基因 表达上调了 72. 7%, 而相同浓度的毛果芸香碱却不影响 Gq 蛋白的基因表达。结论 氨甲酰胆碱激活 NNMR 后, G 蛋 白 4 个亚家族中只有 Gq/11 家族中的 Gq 蛋白基因
4、表达发 生了变化, 可以推测 Gq 蛋白在 NNMR 的信号转导中发挥了 主要的作用。 关键词: 非神经性 M 受体; 血管内皮细胞; G 蛋白; 氨甲酰胆 碱; 毛果芸香碱 血管内皮细胞具有重要的功能作用, 乙酰胆碱 (acetylcholine,ACh) 诱发内皮依赖性血管舒张反应 是检验血管内皮细胞功能是否正常的经典指 标 1, 2。ACh 诱发的内皮依赖性血管舒张反应被认 为是由血管内皮细胞非神经性 M 受体 (non-neuronal muscarinic receptor,NNMR) 介导的 3。NNMR 是一 种非神经性 M3受体, 因其具有重要的生物学功能 而逐渐成为研究热点,
5、 其药理学特征与神经性 M3 受体不同, 主要表现为 M 受体广谱激动剂毛果芸香 碱不能激活 NNMR 4 6。NNMR 信号转导途径与神 经性 M3受体是否相同, 其与何种 G 蛋白亚型偶联, 通过激活该亚型产生一系列级联反应, 最终诱导血 管舒张反应, 目前未见报道。 G 蛋白广泛存在于各种组织细胞的内表面, 它 们将从受体来的信号传入细胞, 通过激活效应酶和 调节离子通道, 导致多种生物效应。G 蛋白为 、 、 3 种亚基组成的异三聚体, 各种 G 蛋白的差别主 要在 亚基, 根据 亚基不同, G 蛋白分为 4 个亚 家族: Gs、 Gi、 Gq/11、 G12/13 家族, 它们由不同
6、的基 因编码, 由于编码产物的剪接方式不同, 又产生多种 亚型。不同的 G 蛋白亚型, 其效应器不同, 产生的 生物学效应也不同。确认与 NNMR 偶联的 G 蛋白 亚型, 进一步明确其效应器, 对于 NNMR 的生物学 功能的认识会产生极大的帮助。本文在培养的大鼠 主动脉血管内皮细胞上, 利用 RT-PCR 技术, 以氨甲 酰胆碱和毛果芸香碱为工具药, 观察激活 NNMR 后, G 蛋白不同亚型基因的表达变化, 从而探讨何种 G 蛋白亚型在 NNMR 的信号转导中发挥作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 M199 培养基、 TRIzol 为 Gibco BRL 公 司产品; 胎牛血清、 小
7、牛血清为 Hyclone 公司产品; 胰蛋白酶、 氨甲酰胆碱、 毛果芸香碱为 Sigma 公司产 品; M-MLV 反转录酶、 Oligo (dT) 15、 dNTP、 RNAsin Ribonuclease Inhibitor、 DNase、 Taq DNA 聚合酶为 Promega 公司产品。GDS-8000 凝胶成像仪为 UVP 公司产品。 1. 2 大鼠主动脉内皮细胞 (rat aortic endothelial cells,RAECs) 的培养及鉴定 无菌条件下分离大 鼠主动脉, 小心剥离周围脂肪组织, 将主动脉纵行剪 开, 平展在平皿内, 用手术刀片将其切成 2 mm 2 mm
8、的小动脉片, 然后内皮向下贴入培养皿内, 超净 台内放置0. 5 h, 加入含胎牛血清和小牛血清体积分 数各 10%的 M199 培养基, 放入 37 5% CO2孵箱 中培养, 3 d 后换液1 次, 细胞基本融合后取下贴片, 继续培养。培养 2 3 代, 八因子免疫组化法鉴定。 取 3 代生长良好无其它细胞污染的内皮细胞, 换入 含 0. 5%小牛血清的 M199 培养基, 分别加入 M199 466中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun; 22 (6) : 664 7 培养基、 氨甲酰胆碱 (carbachol) 、 毛果芸香碱
9、 (pilo- carpine) , 药物终浓度为 10 -4 molL -1, 给药后 6 h 提取细胞总 RNA。 1. 3 总 RNA 提取 按 TRIzol 试剂盒操作方法提 取细胞总 RNA, 加入 DNase 以防止 DNA 污染, 取少 量做总 RNA 定量, 调整浓度为 1 gL -1, 冻存于 -70。 1.4 cDNA 合成 按 M-MLV 反转录酶推荐方法进 行, 反应终体积为 25 l, 其中总 RNA 2 l, 0. 5 g L -1 Oligo (dT) 152 l, 10 mmolL -1 dNTP 1. 25 l, 5 buffer 5 l,RNasin 0.
10、75 l,M-MLVRT 1 l,Nu- clease free water 13 l。PCR 扩增仪上运行: 70 5 min; 42 60 min, 70 15 min; 4保存。 1. 5 PCR 反应 G 蛋白各亚型和作为内参照的 - actin PCR 反应寡核苷酸引物由上海生工公司合成, 引物序列见 Tab 1 7, 8。PCR 反应终体积为 25 l, 其中 50 mol L -1 上下游引物、 10 mmol L -1 dNTP、 5 Ul -1 Taq 酶各 0. 5 l, 上述方法合成的 第一链 cDNA 2 l, 10 buffer 2. 5 l, dd H2O 18.
11、5 l。PCR 反应条件: 94 5 min; 94 30 s, 55 30 s, 72 60 s, 30 个循环; 72 10 min。以模板为不 经过反转录的总 RNA 作为阴性对照, 扩增产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳, UVP GDS-8000 凝胶成像仪进 行图像分析。 Tab 1 PCR primers used for partial directed synthesis of G protein subtypes and -actin PrimesNucleotide sequencesSizes (bp) Gq-sense5ACG ACT TGG ACC GTG TGG CTG
12、3261 Gq-antisense5 CCA TTC GGT TCT CAT TGT CTG 3 G11-sense5 GGA CCG CAT CGC TAC AGT AG 3254 G11-antisense5 CCA TGC GGT TCT CGT TGT CCG 3 G12/13-sense5 CAA CGT CTC CAT CAT CCT CTT C 3227 G12/13-antisense5 GAG AAC ATC CGC TTC GTG T 3 Gs-sense5 GCG ATG AAC GCC GCA AGT G 3317 Gs-antisense5 GCG TGG GTC C
13、TC TCC GGG 3 Gi-sense5 TAC AGC AAC ACC ATC CAG TC 3350 Gi-antisense5 AAG TGG GTT TCT ACG ATG CC 3 -actin-sense5 -CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G 3 200 -actin-antisense5 -GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC 3 1. 6 统计学处理 采用 SAS 统计软件进行统计分 析。实验数据以%x s 表示, 组间比较采用 Dunnett-t 检验分析。 2 结果 2. 1 G 蛋白各亚型在大鼠主动脉内皮细胞的基因 表达 琼
14、脂糖凝胶电泳显示扩增产物分别为与预期 长度相匹配的特异性条带。以未经 RT 的总 RNA 进行 RT-PCR, 未扩增出特异条带, 作为阴性对照, 以排除样品中 DNA 污染。电泳图显示 G 蛋白 4 个 家族中只有 Gq/11、 Gs、 Gi 在内皮细胞有表达, 而 G12/13 在退火温度为 51、 53、 55、 57 条件 下, 均未扩增出目的条带, 表明其在内皮细胞上无表 达。其中 Gq、 G11 蛋白的基因扩增产物进行了测 序, 符合相应 GenBank 数据。用 GDS-8000 Labworks 对电泳结果进行图像分析, 以各基因条带灰度值与 相同模板 -actin 条带灰度值
15、的比值作为 mRNA 表 达的相对值。Gq、 G11、 Gs、 Gi 的相对表达值分别为 0. 22 0. 04, 0. 26 0. 02, 0. 96 0. 07, 0. 28 0. 04, 其中 Gs 蛋白表达量最为丰富 (Fig 1) 。 Fig 1A RT-PCR analysis showing the G-protein subunits mRNA expression in rat aortic endothelial cells -actin used as internal control. The longth of marker are 600, 500, 400, 30
16、0, 200, 100 bp Fig 1B mRNA expression of G-protein Gq,G11, Gs, Gi, subunits in rat aortic endothelial cells. Data,expressed as a ratio of G-protein RT-PCR products devided by -actin RT-PCR products,are means (%x s, n =4) 2. 2 激活 NNMR 对 G 蛋白不同亚型基因表达的 影响 氨甲酰胆碱和毛果芸香碱 10 -4 molL -1分 别作用于大鼠主动脉血管内皮细胞 6 h
17、后, Gq/11 家族的 G11 蛋白、 Gs 家族、 Gi 家族基因表达不发生 变化, 只有 Gq/11 家族的 Gq 蛋白在氨甲酰胆碱作 用下表达量上调了 72. 7%, 与药物处理前相比差异 有显著性 (P 0. 01, n = 4) 。而相同浓度的毛果芸 香碱却不影响其基因表达 (Fig 2) 。 566中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun; 22 (6) Fig 2A RT-PCR analysis showing Gq protein,G11 protein, Gs protein,Gi protein mRNA exp
18、ression in rat aortic endothelial cells treated by M-199 medium (con) ,carbachol (carb) 10 -4 molL -1,pilocarpine(pilo)10-4 molL -1 for 6 h -actin used as internal control. The longth of marker are 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp Fig 2B mRNA expression of G-protein Gq,G11, Gs, Gi subunits in rat aor
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