灯盏花素抑制肾上腺素诱导的心肌细胞内钙升高的机制.pdf
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1、第3 4 卷黑龙江医学 V o L3 4 ,N o 8 5 8 82 0 1 0 年第8 期H E IL O N GJ I A N GM E D I C A LJ O U R N A LA u g 2 0 1 0 灯盏花素抑制肾! - 1 1 3 素诱导的心肌细胞内钙升高的机制 张锐潘振伟2 + ( 1 黑龙江省医院,黑龙江哈尔滨1 5 0 0 0 1 ;2 哈尔滨医科大学药学院药理教研室,黑龙江哈尔滨1 5 0 0 8 1 ) 摘要:i l l 的探讨灯盏花素抑制肾上腺素诱导的心肌细胞内钙升高的机制。方a t培养乳鼠心肌细 胞,经F l u o 一3 A M 染色后应用激光共聚焦技术检测细胞
2、内钙水平。结果灯盏花素( 1 0 、3 0 、1 0 0 斗M ) 显著 抑制肾上腺素诱导的细胞内钙升高及细胞体积增大。灯盏花素抑制氯化钾( K C l ) 诱导的细胞外钙内流,但 对L 一型钙通道开放剂B A Y K8 6 4 4 诱导的细胞内钙升高无影响。另外,灯盏花素能够抑制咖啡因介导的细 胞内钙升高。结论灯盏花素通过抑制外钙内流和内钙释放降低细胞内游离钙的浓度,其抑制外钙内流的 作用与L 一型钙通道无关。 关键词:灯盏花素;细胞内钙:乳鼠心肌细胞;肾上腺素 d o i :1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 4 - 5 7 7 5 2 0 1 0 0 8 0 1 0
3、学科分类代码:3 1 0 5 1中图分类号:R 一3 3 2文献标识码:A M e c h a n i s mo fS c u t e l l a r i nI n h i b i t i o nF u n c t i o no nE p i n e p h r i n eI n d u c e d I n t r a c e l l u l a rC a l c i u mI n c r e m e n ti nC a r d i a cM y o c y t e s Z H A N GY u e ,P A NZ h e n w e i ( D e p a r t m e n to fP h
4、 a r m a c o l o g y ,t h eH o s p i t a lo fH e i l o n 百i a n gP r o v i n c e ,H a r b i n1 5 0 0 0 1 ,C H I N A ) A b s t r a c t :0 b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fs c u t e l l a f i ns u p p r e s s e dt h ei n c r e m e n to fi n t r a c e l l u l a rc a l c
5、i - a mi n d u c e db yE p i n e p h r i n e M e t h o d sN e o n a t a lc a r d i a cm y o c y t e sw e r el o a d e dw i t hF l u o 一3 A M ac a l c i u mi n d i c a t o r T h ei n t r a c e l l u l a rc a l c i u ml e v e lw a se x a m i n e du s i n gl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r
6、 o s c o p e R e s u l t s C u l t u r e d n e o n a t a lc a r d i a cm y o c y t e se x p o s e dt oE p i n e p h r i n ea p p e a r e ds i g n i f i c a n te n l a r g e m e n to f c e l ls i z ea n dt h ei n c r e m e n t o fi n t r a c e l l u l a rc a l c i u m T r e a t m e n tw i t hs c u t
7、e l l a r i ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h e s ea l t e r a t i o n s S c u t e l l a r i na p p a r e n t l y i n h i b i t e dK C Li n d u c e di n c r e m e n to fi n t r a c e l l u l a rc a l c i u m w h i l ep r o d u c e dn oe f f e c to nL t y p ec a l c i u mc h a n n e lo p
8、 e n e r B A Y K 8 6 4 4 。c a u s e di n t r a c e l l u l a rc a l c i u mi n c r e m e n t M o r e o v e r ,s c u t e l l a r i np r e t r e a t m e n ta l l e v i a t e dc a f f e i n e i n d u c e di n t r a c e l l u l a rc a l c i u mr e l e a s e C o n c l u s i o n T h i ss t u d yi n d i c
9、a t e ds c u t e l l a r i ns u p p r e s s e dt h ei n t r a c e l l u l a ri n c r e m e n tb yi n h i b i t i n gb o t he x t r a c e l l u l a rc a l c i u mi n f l u x ,w h i c hi si n d e p e n d e n to fL t y p ec a l c i u mc h a n n e l ,a n di n - t r a c e l l u l a rr e l e a s e K e yw
10、o r d s :S c u t e l l a r i n :I n t r a c e l l u l a rc a l c i u m ;N e o n a t a lc a r d i a cm y o c y t e ;E p i n e p h r i n e 灯盏花素是从云南特有的菊科植物灯盏细辛 中提取的中药活性成分。现代药理学研究表明,灯 盏花素具有舒张血管平滑肌、保护缺血损伤的心肌 细胞和神经细胞、抑制心肌细胞肥大、抑制血小板 基金项目:第四十四批博士后科学基金 ( 2 0 0 8 0 4 4 0 9 1 5 ) 作者简介:张锐( 1 9 7 8 一) ,男,汉族,主治医师
11、,硕士 研究生。 木通讯作者。 聚集等多种药理作用2J 。目前,灯盏花素以片剂、 注射剂等不同剂型广泛应用于心脑血管系统疾病 的治疗。有研究表明,长期应用灯盏花素能够对抗 异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥大旧J 。我室前期 研究发现,灯盏花素通过抑制细胞外钙内流与内钙 释放而降低血管平滑肌细胞内钙,继而发挥松弛平 滑肌的作用嵋J 。由于细胞内钙升高是心肌细胞肥 大的重要机制之一。因此,我们认为,灯盏花素可 能通过抑制细胞内钙升高而对抗心肌肥大。本研 究中,我们主要探讨灯盏花素对肾上腺素诱导的心 万方数据 第3 4 卷 2 0 1 0 年第8 期 黑龙江医学 H E IL O N GJ I A N
12、GM E D I C A LJ O U R N A L V o L3 4 ,N o 8 A u 昏2 0 1 0 5 8 9 肌细胞内钙升高的抑制作用及机制。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 动物:新生1 3d 的W i s t a r 大鼠,雌雄不 限。由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中 心提供。 1 1 2 药品和试剂:高糖型D M E M ( 北京海克隆生 物化学制品有限公司) ,小牛血清( 天津市灏洋生物 制品科技责任有限公司) 。兔抗大鼠a 肌小节肌动 蛋白单克隆抗体( 分子探针公司,美国) 、胰蛋白酶、 苯肾上腺素、B A Y K 8 6 4 4 、咖啡因购自美国S
13、i g m a 公 司;F l u o 一3 A M 购自美国I n v i t r o g e n 公司;灯盏花素 购自云南玉溪望子隆药业有限公司。 1 1 3 仪器:水浴锅( 常州国华电器有限公司) ,细 胞培养箱( T h e r m o 公司) ,激光扫描共聚焦显微镜 ( 美国M E R I D I A N 公司) ,离心机( 上海东亭科学仪 器厂) ,O L Y M P U SI X S 0 倒置显微镜( O l y m p u s 公 司) 。 1 2 乳鼠心肌细胞分离与培养( 4 】 取1 3d 新生乳鼠,无菌条件下取出心脏,用 D M E M 冲洗后,剪成1 0m m 1 0m
14、 mX1 0m m 的 碎块。2 5g L 胰蛋白酶消化,3 7 ,1 5m i n 次,共 4 次。2 0 0 目的滤网过滤后,25 0 0r m i n ,离心 2m i n ,弃去上清液,用1 0 小牛血清的D M E M 培 养,2h 后加入0 1m m o l L5 一溴脱氧尿核苷( B r - d u ) ,4 8h 后换液。 1 3 细胞面积测定 乳鼠心肌细胞经苯肾上腺素和灯盏花素处理 后,应用a l p h a a c t i n 染色,在荧光显微镜下拍照。 应用I m a g eP r oP l u s5 0 软件计算单个细胞面积。 以处理组同正常组的比较值表示细胞面积变化。
15、 1 4 心肌细胞F l u o 一3 A M 染色与激光共聚焦钙 测定4 】 取待用细胞,加入5 0 “M 的F l u o 一3 A M ,置于 细胞培养箱中孵育4 5m i n ,用钙台式液冲洗并浸泡 1 0m i n 后,即可用于检测。选择细胞状态良好的视 野,应用F V 一3 0 0 激光扫描共聚焦显微镜检测细胞 内钙,激光波长为4 8 8n m ,接收波长为5 2 5a m 。细 胞内钙的变化应用荧光峰值( F m a x ) 基础荧光 ( F O ) 表示。 1 5 统计学处理 数据应用均值标准差( 盂s ) 表示。多组比 较应用F 分析( O n e w a yA N O V
16、A ) 结合D u n n e tt 检 验进行处理。P ;elo叱一 万方数据 第3 4 卷 5 9 02 0 1 0 年第8 期 黑龙江医学 H E IL O N GJ I A N GM E D I C A LJ O U R N A L V 0 1 3 4 N o 8 A u 昏2 0 1 0 董3 O o 22 o 壹1 o 比 。0 K C L + S c u ( p M ) 图3 灯盏花素对K C L 诱导的心肌细胞内钙升高的影响 C o n ( 对照组) ;S o u ( 灯盏花素) # # P O 0 l ; P o 0 5 :母+ P 0 0 1 2 3 灯盏花素对L 一型钙通
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